第七章细胞悬浮培养与次生物生产.ppt

第七章 细胞悬浮培养与次生植物物 质的生产Cell suspension culture and production of secondary meltabolites 陈惠教授 细胞悬浮培养(cell suspension culture)一般是先把未分化的易碎的愈伤组织转移到液体培养基中，并使用适当的设备进行连续的振荡培养。 细胞悬浮培养物是由分散的生长在振荡液体培养基中的细胞聚集体组成的。 振荡的目的? 振荡能对细胞聚合体施加轻微的压力使其分散为较小的细胞团和单个细胞。 振荡可以使介质中的细胞团分布均匀。 使培养介质和空气之间进行良好的气体交换。 振荡器 1.水平摇床往复式转动, 转速30-150r/min 2. 旋转式转动. 3.容器大小与装液量 100ml三角瓶---装液20mlpyj， 250ml三角瓶----装液70mlpyj 7.2 单细胞的获得 机械法：起始物从无菌幼苗的叶片、吸涨的胚等外植体开始。 1. 材料:叶片,撕去表皮,用解刨刀直接刮取细胞; 2.将叶片剪成小块后,轻轻研磨叶片等组织，较柔软的组织可以用手动的玻璃匀浆器打碎成匀浆，得到的匀浆中含有完整的活细胞、死亡细胞和细胞碎片，要进行过滤和离心把细胞纯化。 实例: Gnanam 等(1969) 从若干种成熟叶片中分离出具光合和呼吸活性的叶肉细胞. 10g叶片 研钵中加40ml研磨介质(20umol蔗糖,10umolMgCI2 20umol tris-HCI 缓冲液,pH7.8)研磨 两层纱布过滤 低速离心纯化细胞. 优点:1.细胞没有受到酶的伤害作用 2.无须质璧分离 酶法 可以用果胶酶(加渗透保护物质如:甘露醇)消化果胶获得单个分散的细胞。 Takebe(1968)证明在离析液中加硫酸葡聚糖钾能提高游离细胞的产量. 由培养组织中分离单细胞 外质体------诱导愈伤—继代---松散愈伤2 g -30-50ml液体------悬浮培养 6号培养基根细胞多为长形细胞 7.3 悬浮培养类型 7.3.1 分批培养（batch culture) 指在一定容积的培养基中进行的细胞悬浮培养从而建立细胞悬浮培养物，在培养过程中，细胞分裂和细胞生长使悬浮培养物的生物量不断增加。当培养环境（可利用的营养和氧气）中出现限制因子时，细胞停止生长，生物量便不再增加。为了使培养物不断增殖必须进行继代培养：方法式取出一小部分液体稀释3-5倍添加新鲜培养基转到新瓶中培养。 分批培养中，细胞周期可分为5个时期 停滞期：细胞分裂准备期 指数期：细胞分裂最快的时期。细胞数目呈指数增长。 线形期：细胞分裂减慢，细胞伸长速度增加。 减速期：细胞分裂和细胞伸长都减小 稳定期：细胞数目和大小保持恒定。 优点：培养装置和操作简单。 缺点：培养过程中细胞生长、产物积累、以及培养基的物理状态常常随时间的变化而变化。培养检测十分困难。 利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。 开放型连续培养 连续的加入新鲜培养基与连续地移出相当体积的溢出流之间保持平衡，而使得培养体积保持不变，而且溢出流中含有收获的细胞。通过调节流入流出速度，使培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的恒定水平上。 封闭型连续培养 排出的旧培养基和流入的新培养基体积相等，且排除的培养基中的细胞经收集又放回到培养系统中，细胞的数目不断增加。 7.3.3. 由悬浮细胞再生植株 两条途径： 1、由悬浮细胞直接形成体细胞胚—如胡萝卜 2、先把悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株。 对于单细胞、低密度悬浮细胞和过于细小的细胞团不宜直接在半固体培养基上培养，可借鉴原生质体培养或单细胞培养的方法，先进行液体浅层培养或看护培养，待形成较大的细胞团后，在转到半固体培养基上诱导愈伤组织。 7.4.生长的测定 密接（压缩）的细胞体积 (PVC packed cell volume) 在严格的无菌条件下，选择一定的间隔期取出少量的培养物（多至10ml),放入1支有刻度的离心管中，在1000g转速下离心5min（或2000g,5min)。读出沉淀细胞的体积即为PVC ， PVC的单位为：沉淀细胞毫升/10毫升培养物或体积百分数。测定PVC后还可以用同一样品测定培养物的鲜重和细胞总数。 优点：简单、快速、有效的一种技术。 缺点：容易产生误差，原因之一是离心后沉降下来的细胞团的表面可能不是水平的，不得不估计数值。只有当细胞悬浮液的颗粒很细，而且采用标准的离心时间和速度时，这项测定技术才是精确的。 鲜重（FW)/干重(DW