[自然科学]第二章工具酶.ppt

用途： 1. 催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’ 末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3’-OH末端。 2. 催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端： 生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。 3. 用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。 碱性磷酸酶： 来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。 S1核酸酶： 来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。 反转录酶（reverse transcriptase）  这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。 体外连接的三种方式： 1. 用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断 2. 用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)- poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ连接酶连接。 3. 先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接 ＤＮＡ连接酶： 能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（ OH ）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。 只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。 酶－－AMP（腺苷－磷酸） 磷酸酰胺键 DNA的腺苷酸复合物 3’-OH对P原子作亲核攻击 形成磷酸二酯键 连接酶的作用机理 此反应是由焦磷酸 (ppi)的水解作用激发的 需要花费两个高能磷酸键 （赖氨酸残基） 连接酶的来源 1. DNA连接酶： 大肠杆菌染色体编码的 2. T4 DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的 DNA连接酶 －－NAD+ T4 DNA连接酶 －－ATP Ｔ４ＤＮＡ连接酶（DNA ligase）  该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。 DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。 影响连接酶作用的因素 1. 反应温度： 连接缺口的温度：37度 连接粘性末端的最佳温度： 4～15度 2.Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量： 平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。 ATP的用量10μmol~1mmol/L之间 3. 提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍） 粘性末端DAN片断的连接 由于具粘性末端的载体易发生自连。 对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。 而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接，形成3’- OH 和5’- OH 的缺口。 平末端DNA片断的连接 1. T4DNA连接酶 2. 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。 常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法 同聚物加尾法 用5’ 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断 在A和B分别中加入dATP和dTTP 同聚物尾巴10~40个碱基 同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，获得插入片断进行进一步的研究。 衔接物连接法 平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。