植物叶片DNA抽提法.docVIP

植物叶片DNA抽提法 A．准备的试剂和材料： 液氮 抽提缓冲液：500mM NaCl, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 50Mm EDTA pH 8.0, 10mM 巯基乙 醇（使用前加入） 上述溶液均以浓缩液的形式配置保存，使用前混合；配置100ml抽提缓冲液的配方为： 5 M NaCl 10ml 1M Tris-HCl pH 8.0 10ml 0.5 M EDTA 10ml 巯基乙醇 70ul 无菌水 70ml 需配制的溶液：20% SDS, 5M KAc（醋酸钾），3M NaAc（醋酸钠）, RNase A(200U/ml), 50 TE RNase A储存液的配置方法：取25mg的RNase A，在25ml的缓冲液中（1M Tris-HCl 250 ul, 5M NaCl 75 ul, ddH2O 25 ml）溶解—100度煮沸15分钟—缓慢冷却至室温—分装为100ul／管，－20度冻存。 50TE配方: 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, (在93ml的无菌水中加入1M Tris-HCl 5ml, 0.5 M EDTA 2ml) 其他材料及设备： 碾钵，灭菌的擦镜纸(事先剪成小块)，保温杯（盛液氮），水浴锅（37℃、65℃），台式冷冻高速离心机（1.5--2.0ml），1.5ml离心管（每个样品精细提取需要3支，粗提需要2支），冰盒，异丙醇，无水乙醇（或新近配制的70%乙醇） B 实验步骤（前面的数据为小量提取法，括号里的斜体划线数据是大量提取法） a): 打开水浴锅，调整温度到65℃，并将20％SDS放在里面预热； b):准备好要用的各种溶液，液氮，擦镜纸，适量的碾钵，离心管架，大冰盒（装满冰），1.5ml 离心管。 c):在离心管和碾钵上编号。 取0.5-0.8克幼嫩的叶子（2克）在碾钵中，倒入液氮快速碾磨成细粉――加入750ul /（7.5ml）抽提液到碾钵中继续碾磨几下，将匀浆液倒入相同编号的1.5ml / (50ml) 离心管中。加入50ul /(0.5ml)预热的20％SDS溶液，上下颠倒混匀数次。 注：样品碾磨要充分，快速，并在低温条件下进行；越新鲜，越嫩的组织越好；SDS要及时加入样品缓冲液 65℃水浴10分钟（中间上下混匀几次）；零下20度预冷5M KAc。 注：时间不能超过，否则样品会被严重氧化。 取出样品，加入250ul /(2.5ml) 预冷的5M KAc，在冰盒中冰浴20－30分钟。13000转离心15分钟（在此期间准备一套1.5ml /(50ml)离心管，编号，将擦镜纸象叠滤纸的方法一样叠好放在上面）；预冷异丙醇。 用枪吸取上清（约900ul），过滤到相应编号的新管子中。加入570ul/ (5ml)预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，于零下20度静置40分钟以沉淀核酸（或者过中午，过夜都可以）。 注：用擦镜纸过滤可以更好的去除色素和杂质，异丙醇一定要在零下20度预冷。 13000转离心15分钟，去上清，晾干或者用冷冻干燥机抽干（约2分钟）。 注：这里的沉淀不能太干，否则会影响50TE的再溶解；如果沉淀难以溶解，可以用65度助溶10分钟。 加入300ul /(700ul)的50 TE将沉淀溶解，再加入3ul /(7ul)RNase A,于37度水浴1小时来去除RNA。 注：这里也可以用4度过夜处理。而且可以先将50TE和RNase A配成混合液再分别加入每个管子中，这样做可以减轻工作量。 在离心管中加入35 ul /(75ul) 3M NaAc轻弹混匀， 静置5分钟，13000转离心15分钟――取上清（沉淀不溶性杂质）。 在上清中加入200ul/（500ul）异丙醇，轻轻混匀，室温放置5分钟后13000转离心15分钟来沉淀DNA。 注：如果发现DNA不能沉淀下来，请考虑异丙醇的质量是否有问题 去上清，在沉淀中加入预冷的70％无水乙醇轻洗沉淀，13000转离心3－5分钟，小心去上清；然后重复上述操作一次。 将洗涤后的沉淀用冷冻干燥机抽干，溶解于30ul 的纯水中；注意在每支DNA管子上注明日期。 取1ul DNA电泳检测，考察所提取的DNA质量和浓度，并吸取一部分的DNA按比例稀释到50ng／ul，冻存于负20度备用。在冻存盒上注明日期、编号的范围，抽提人姓名等字样。 注：电泳时用DL2000做Marker，每（5 ul）一条电泳带为50ng。 总结：这个方法是精细提取叶片总DNA的方法，提取的DNA在低温条件下可以低温保存半年以上。 粗提植物DNA （样品仅能存放三天，可以用来做PCR检测） 取样品，与液氮中碾磨 在碾钵中加入750ul抽提缓冲液