[自然科学]第11章 基因表达和功能的.pptVIP

第十一章 基因表达和功能的研究 主要内容 克隆基因转录的研究 对基因是否有内含子以及转录的起始点和终止点进行的研究 基因表达调控的研究 鉴定和研究克隆基因的翻译产物 11.1. 克隆基因转录的研究 对于转录的起始点、终止点和基因是否具有内含子等的研究 11.1.1电子显微镜分析核酸分子 11.1.2 通过核酸酶处理来研究DNA-RNA杂交物 确定基因是否含有内含子 确定基因转录起点的位置 确定转录起始的位置 首先将可能的包含转录起始点以及上游的DNA克隆进入载体，获得单链的DNA片段 加入转录物，进行温育，退火，杂交 用S1核酸酶降解单链部分，获得RNA-DNA杂合双链 通过碱变性，降解RNA 检测被RNA保护的DNA片段的长度 判断所克隆的DNA片段中转录起始点的位置 11.1.3 通过引物延伸来研究转录物 确定转录起始点的研究 获知转录物的部分序列 设计引物 通过反转录对引物延伸 对产物进行检测 确定转录的起始点位置 11.1.4 其他研究RNA转录的技术 Northern杂交（自习） 定义 应用的范围 11.1.4 其他研究RNA转录的技术 反转录PCR（见第八章） 11.1.4 其他研究RNA转录的技术 cDNA 末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends, RACE） 5’-RACE 3’-RACE 3、人工合成的接头引物的3’末端具有寡聚G，与寡聚C配对合成第二链cDNA。 4、利用基因特异的引物作为下游引物和用一个含有部分接头序列的通用引物(universal primer,UPM)作为上游引物扩增基因的5‘末端。 11.2 基因表达调控的研究 研究调控区域的存在以及所发挥的作用 研究调控区域DNA分子的蛋白结合区域 11.2 基因表达调控的研究 12.2.1 识别DNA分子的蛋白结合区(DNA-蛋白的相互作用的方法) 凝胶阻滞实验 DNA酶I足迹法 修饰干扰实验 修饰干扰实验 碱基被修饰后,影响了其与蛋白质的结合能力,从能被蛋白结合的到不能被蛋白结合. 11.2.2 通过缺失分析来识别调控序列 报告基因 通过报告基因转入宿主中,区别原有的在基因组中的基因的拷贝 报告基因具备的两个特点(P201) 缺失分析 将具有不同程度缺失的调控序列与报告基因融合的载体,转化给宿主,检测宿主中报告基因的表达模式以及强度的方法 11.3 鉴定和研究基因的翻译产物 HRT和HART能够识别克隆基因的翻译产物（自习） 11.3 鉴定和研究基因的翻译产物 11.3.2 通过体外突变研究蛋白质 不同类型的体外突变 技术（主要是蛋白质编码序列部分的缺失、插入等的操作技术） 11.3.2 通过体外突变研究蛋白质 用寡核苷酸在克隆基因上导入点突变 借助于M13单链和双链的特殊形式，将目标突变导入，筛选出一半突变了基因。并通过表达载体上突变了基因的表达，研究点突变对蛋白质功能的影响。具体的过程如P207，图11.25 11.3.2 通过体外突变研究蛋白质 其他定点突变 A、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征 由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。 11.3.2 通过体外突变研究蛋白质 其他定点突变 B、人工基因合成方法 1、原理 利用一段人工合成的150甚至更长的碱基（内含需要突变的位点）,通过部分重叠和DNA聚合酶的延伸完成整合基因的多个位点的突变。 11.3.2 通过体外突变研究蛋白质 其他定点突变 C、定点诱变的PCR方法 根据靶DNA序列设计一对互补的内侧引物A和A’(引物A和A’互补)，他们在相同的位点具有同样的碱基突变； 分别以左侧引物A和右侧引物A’进行两轮PCR扩增； 除去未参入的多余引物，由于具有重叠序列，故经变性和退火形成异源双链分子 其中只有具3’凹陷末端的双链分子可通过TaqDNA聚合酶的及外侧引物B和C的作用下，形成其突变位点是位于靶DNA序列中但远离两端的突变体。 11.3.3 蛋白与蛋白之间的相互作用的研究 1、噬菌体展示技术原理 A、噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达。 B、融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。 C、被展示的多肽或蛋白