蛋白质与DNA的相互作用教材教学课件.pptVIP

蛋白质与DNA的相互作用 分类： 与单链RNA结合 与茎环结构结合 与双链DNA结合：普遍性结合 特异性结合 蛋白质与DNA结合的特性： 1.DNA识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。 2.蛋白质和DNA的接触区只在DNA的一侧。 3.在结合过程中，蛋白质和DNA都有构像改变。 4.普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与DNA骨架的磷酸基团形成离子键。 5. 特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与DNA特定硷基接触。 蛋白质与DNA的普遍性结合中DNA特点： 蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。 与DNA硷基序列特异性无关 结构的匹配性： 旋转对称性 特定距离的相反电荷 形成氢键基团排布上的匹配 形成足够大的范德华力 1.蛋白质和DNA都存在0.7nm 的重复距离 DNA双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是0.7nm。 β—折叠，N原子间距离是0.7nm 伸展β—折叠Cβ间距离是0.7nm α—螺旋，Arg和Lys被另外三个残基隔开，带正电荷侧链的距离是0.7nm. 2.DNA对称性 平移对称： GCATCT GCATCT CGTAGA CGTAGA 二重轴对称 GCATCT TCTACG CGTAGA AGATGC 二重旋转对称 GCATCT AGATGC CGTAGA TCTACG 旋转对称 GCATCT CGTACA CGTAGA GCATGT 蛋白质与DNA特异性结合中DNA特点： 大沟内存在特异性识别信息 氨基酸与碱基对共平面 氨基酸和碱基对之间形成氢键 N N O H N N N H N N O N H C O O C C N H H N H H H Glu Agr H HTH复合物 同源盒结构 亮氨酸拉链结构 NH2 COOH 碱性氨基酸Agr和Lys 锌指结构 Agr和G形成氢键 细胞核蛋白质的提取 收集细胞，洗去血清和培养基 裂解细胞：Triton X-100 NP-40 去胞浆成分 裂解细胞核：高浓度KCl :600mM 变更缓冲液浓度 快速抽提 裂解液： 提取液： 10mM HRPES 250mM Tris 1mM EDTA 60mM KCl 60mM KCl 1mM DTT 1mM DTT 1mM PMSF 1mM PMSF pH 7.9 0.5% NP-40 pH 7.9 1X107细胞 100ul裂解液、冰浴5分钟、离心 沉淀 用不含NP-40的裂解液洗一次 100ul提取缓冲液 干冰异丙醇速冻，反复冻融3次 离心 沉淀 —800C保存 凝胶滞后试验 1.蛋白质和DNA结合复合物半衰期短 电泳缓冲液低离子强度 凝胶的笼效应 2.探针以20-200bp 为宜。过小不利于蛋白结合，过大增加非特异性结合。 3.用竞争性抑制检测DNA与蛋白质结合的特异性 4.加3ug Poly(dI-dC)减少非特异性结合 5.超级凝胶电泳增强蛋白质的凝胶阻滞作用 6.只能确定结合，无法确定序列 DNA足迹分析 DNA足迹分析 1.DNAas