[高等教育]3载体.pptVIP

目的基因 受体生物 ？ 基因怎么导入受体？ 目的基因 基因载体 重组体 分 切 接 转 筛 基因工程技术路线 第三章 载体 Chapter 3 Vector 基因工程 在基因工程中，把能够携带外源基因（或DNA片段），进入细胞复制、整合或表达的DNA分子就称为载体（Vector）。 载体的概念 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 有能使目的基因插入的多克隆位点。 能携带外源DNA进入受体细胞。 有供选择转化子的标记基因。 在宿主细胞内可独立复制。 载体必须具备的条件 pBR322 多克隆位点（multiple cloning site, MCS），是包含多个限制性酶切位点的一段很短的DNA序列，是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。在MCS中，每个限制性酶切位点通常是唯一的。 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。 其他需要注意的问题 载体的分类 按照功能： 克隆载体：用于克隆一个基因或DNA片断； 表达载体：用于目的基因的表达； 整合载体：把一个基因插入到染色体组中（补充） 按载体的来源： 质粒载体，噬菌体载体，粘粒，人工染色体载体等 按受体细胞： 原核生物载体和真核生物载体 第三章 载体（Vector) 第一节 克隆载体 第二节 表达载体 第三节 整合载体 第一节 克隆载体 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 人工染色体载体 （一） 质粒的概念 一种存在于天然细菌体内的独立于细菌染色体的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。 大肠杆菌的质粒 一.质粒载体(Plasmid) 质粒的宿主：质粒广泛存在于细菌细胞中，也出现在某些蓝藻、绿藻、眼虫、衣藻和真菌等细胞中。 质粒的本质：绝大多数的质粒是DNA型的，但是在自然界还发现了RNA质粒，如酵母的杀伤质粒(killer plasmid)。 质粒的大小：多数质粒DNA分子在10 kb左右，小的不足2 kb，大的可达100 kb以上，DNA分子很大的质粒也称为巨型质粒分子量范围1-200 Kb （二） 质粒的基本性质 1. 质粒的复制与拷贝数 质粒的复制：质粒自己的复制起始区（ori)和相关顺式元件，能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 ori E.coli ColE1 plasmid 复制方向 rop （+） Rop RNA II RNA I 3’ 5’ 5’ 3’ 质粒的拷贝数：在正常生长条件下，细胞内某种质粒的数量与染色体的数量之比。 根据拷贝数的数多少，质粒可分为两大复制类型： 严紧型（stringent plasmid）：拷贝数少的质粒（1至数个拷贝）。 松弛型（relaxed plasmid）：拷贝数多的质粒（10个拷贝上）。 质粒的拷贝数——cop和rep基因的双重控制 Cop Rep translation translation Pcop cop P/Orep rep ori 2. 质粒的不相容性（incompatibility) 在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在在同一宿主细胞中稳定共存的现象称为质粒的不相容性。 注意： 亲缘关系近的质粒一般属于不亲和性质粒。野生型质粒与其衍生的重组质粒通常属于不亲和性质粒，因此作为受体细胞最好不含内源质粒。 质粒不相容性的机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 质粒不相容性的机制 3. 质粒的转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒（conjugative plasmid） 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）的质粒。 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用的质粒。 机制：结合型质粒有tra基因，该基因能使宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致质粒甚至部分染色体从一个细胞转移到另一个细胞中。接合质粒的分子一般比较大，拷贝数比较少，并且宿主广，使用时应特别注意其安全性。 质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。 不含tra基因的质粒中若含有mob基因的bom顺式元件以及nic位点