05第五讲 蛋白质结构解析技术(二)PPT.ppt

本节小结 核磁共振有关的概念、原理及应用。 核磁共振仪的工作原理 样品的测定程序和步骤 了解蛋白质的NMR解析步骤 第四节 质谱技术 简单介绍概念和原理，在蛋白质组学中再详细介绍 一、概述 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 1.气体扩散 2.直接进样 3.气相色谱 1.电子轰击 2.化学电离 3.场致电离 4.激光 1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间 4.四极杆 质谱仪需要在高真空下工作：离子源（10-3 ?10 -5 Pa ） 质量分析器（10 -6 Pa ） 1．大量氧会烧坏离子源的灯丝； 2．用作加速离子的几千伏高压会引起放电； 3．引起额外的离子－分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化。 一、质谱分析原理 电离室原理与结构 仪器原理图 原理与结构 质谱仪分析原理 S/N≥10 质子化学位移不同的原因 分子中没有完全裸露孤立存在的质子 给定照射频率下，原子核外电子云产生感应磁场，与H0磁场方向相反，对H0的磁场具有屏蔽作用。 质子产生共振需要更大的外磁场强度（相对于裸露的氢核），来抵消屏蔽影响。 感生磁场强度与H0关系 感生磁场强度——以屏蔽常数（ σ)表示，与H0成正比例关系， 电子云密度越大、屏蔽作用越大、 σ越大 质子核感受到的磁场强度将减小：H0(1-σ)： 核共振吸收的频率 与H0的关系： ?0 = [? / (2? ) ] H0 (1- ? ) 屏蔽常数“σ” 反映电子云对质子的屏蔽作用— 不同环境中的质子发生不同的化学位移 （2） 化学位移表示方法 从吸收频率来看，“化学位移”的单位为“Hz” 60 MHz仪器，质子共振频率变化约在1000 Hz 100 MHz仪器，质子共振频率的变化约在1700 Hz H0不同，共振产生的频率不同，无法比较。 要求测定几个Hz的精度，测定绝对值非常困难 因此，采用相对值的方法表示 “化学位移” （A）1970年 IUPAC（国际纯粹与应用化学协会）建议： 化学位移用位移常数（δ）来表示，单位：ppm 扫频： δ =（ν样品- ν标准）×106/ ν标准 = （ν样品- ν标准）×106/ ν仪器 扫场： δ =（H样品- H标准）×106/ H标准 = （H样品- H标准）×106/ H仪器 仪器：数十MHz到数百MHZ； 测定差值：几十 Hz 至 几百 Hz 比值：百万分之几，所以×106 ，单位：ppm （2） 化学位移表示方法 （2）化学位移的表示方法 （B) 位移的标准 　　没有完全裸露的氢核， 没有绝对的标准。 相对标准： 四甲基硅烷　Si(CH3)4 ，简称：TMS，（内标或外标） 位移常数 ?TMS=0 （ 1970年 IUPAC 规定） (C) 为什么用TMS作为基准? a. 12个氢处于完全相同的化学环境，只产生一个尖峰； b. 屏蔽强烈，位移最大。与有机化合物中的质子峰不重迭； c. 化学惰性；易溶于有机溶剂；沸点低，易回收。 （2）位移的表示方法 与裸露的氢核相比，TMS的化学位移最大，但规定 ?TMS=0，其它种类氢核的位移为负值，负号不加（省略）。 ? = [( ?样 - ?TMS)/ ?TMS ]?106 (ppm) ?小，屏蔽作用强，共振需要的磁场强度大，在高场出现，图右侧； ?大，屏蔽弱，共振需要的磁场强度小，在低场出现，图左侧； （D）表示规则 2、影响化学位移的因素（4个因素） （1）电负性—去屏蔽效应 与质子相连元素的电负性越强，吸电子作用越强，价电子偏离质子，屏蔽作用减弱，信号峰在低场出现。 -CH3 ? =1.6~2.0，高场； -CH2I ? =3.0 ~ 3.5, 位移增大 -O-H， -C-H， ? 大 ? 小 低场 高场 图1和图2 质子的化学位移有何不同？Why？ 图1 甲醇的1H NMR 图1 碘乙烷的1H NMR 电负性对化学位移的影响（了解） 碳杂化轨道电负性：SPSP2SP3 （2）磁各向异性效应 价电子产生诱导磁场，质子位于其磁力线上，与外磁场方向一致，对质子具有去屏蔽。 （3）氢键效应 形成氢键后1H核屏蔽作用减少，氢键属于去屏蔽效应。 原子之间的相互作用力的变化 测定物质之间的相互作用 （4