13第十三章细胞生物学研究方法PPT.ppt

第十三章 细胞生物学研究方法;进行初步观察;Caenorhabditis elegans;第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术（light microscopy） 1.普通复式光学显微镜技术 （1）光镜样本制作 （2）分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 2.荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） （1）直接荧光标记技术 （2）间接免疫荧光标记技术 （3）在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用;;;3.激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重构样品的三维结构。 4.相差显微镜（phase-contrast microscope） 5.微分干涉显微镜（differential interference contrast microscope, DIC） 6.录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）;二、电子显微镜技术 (Electro microscopy) 1.电子显微镜的基本知识 2.主要电镜制样技术 （1）负染色技术 （2）冰冻蚀刻技术 （3）超薄切片技术 （4）电镜三维重构技术 3.扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM） 三、 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope );电子显微镜的基本构造;;;;第二节 细胞组分的分析方法 一、离心分离技术 1.用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 2.差速离心：分离密度不同的细胞组分 3.密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离 二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。如Feulgen Staining。;;;三、特异蛋白抗原的定位与定性 1.免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 2.蛋白电泳(SDS)与免疫印迹反应(Western-Blot) 3.免疫电镜技术 （1）免疫铁蛋白技术 （2）免疫酶标技术 （3）免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。;;;;四、细胞内特异核酸的定位与定性 1.光镜水平的原位杂交技术 同位素标记或荧光素标记的探针 2.电镜水平的原位杂交技术 生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合。 3.PCR技术;五、放射自显影技术 1.原理及应用 （1）利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； （2）实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 2.步骤： 前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） ———放射自显影;六、定量细胞化学分析技术 1.细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry） 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。包括：紫外光显微分光光度测定法、可见光显微分光光度测定法 2.流式细胞仪（Flow Cytometry） 主要应用： 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。 ;;第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞的培养 1.动物细胞培养 （1）类型： 原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） （2）细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制 （3）细胞系（cell line） 亚二倍体，接触抑制丧失;Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养;2.植物细胞 （1）原生质体培养 （体细胞培养） （2）单倍体细胞培养（花药培养） 3.非细胞体系（cell-free system） 二、细胞工程 1.细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 2.单克隆抗体（monoclone antibody）技术;;;3.细胞拆合与显微操作技术 （1）物理法结合显微操作技术 （2）化学法结合离心技术 （3）制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。 4.其它技术 遗传分析（mutan