[生物学]基因文库的构建.pptVIP

基因文库的构建 基因文库的构建流程 构建基因组文库应注意的问题  1、构建一个文库，插入DNA和载体DNA的质量是成功与否的关键。基因组DNA应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。 2、不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染少量探针顺序或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过程中它们将被鉴定为所要的克隆。 3、部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱基的限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有效地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和DNA浓度及纯度。 4、在考虑把λ噬菌体臂和插入DNA片段连接过程中有两个重要参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和纯度。大约10pgλ噬菌臂和4μgDNA能产生有效地包装。对一个典型的基因组，要产生一个可表达文库，重组子数一般要大于1×106~6×l06。 5、包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多。而在-70℃中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量高，且在体外包装λ噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的噬菌斑。 Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA双链和载体的连接 转化或转染 快速鉴定 pBlueScript cDNA库扩增 Oligo（dT）引导的 cDNA 合成是指 Oligo（dT）引物与 mRNA 3 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 这种 cDNA 合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为普遍，其缺点是由于 cDNA 末端存在较长的 poly（A）而影响 cDNA 测序。 随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的起点。 由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 mRNA 分子的 5‘端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5 末端，如 RT-PCR 和 5-RACE 。 利用PCR技术构建cDNA文库 ① 能够从极其有限的起始材料中构建cDNA文库。 ② 以总RNA为模板合成cDNA，无需mRNA的纯化，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。 ③ 能够提高cDNA文库的完整性，获得那些低水平表达的基因的cDNA克隆。此法对植物基因功能的研究，如对某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研究尤为适用。 应用差别杂交法构建cDNA文库： 适用于分离经特殊处理而被诱发表达的cDNA克隆； 技术基础：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达； 可以通过这两种总mRNA（cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对有目的基因表达的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。 应用扣除杂交法构建cDNA文库： 不是细胞内所有表达基因全体的集合，而是主要含差异表达基因的部分cDNA的集合； 用过量的参照细胞mRNA或cDNA与目的细胞cDNA或mRNA(又称目的序列)杂交，形成的RNA-cDNA杂交体是两种细胞共有的，将其扣除；剩下的cDNA或mRNA可以标记成探针(称减法或扣除探针)，从上述目的细胞的cDNA文库中筛选目的克隆； 实质上是除去了一大批高丰度非特异性的cDNA，含有的是特异表达的cDNA克隆及其它一些低丰度mRNA的cDNA克隆。 从基因文库的大量克隆中鉴定出某个含有目的基因的特定克隆的过程，称为筛选； 筛选过程通常需要一个核酸探针进行杂交，该探针可以与其互补序列结合从而检测出含目的基因的克隆； 将菌落或噬菌斑转移到膜上，将其置入含放射性标志探针溶液中保温，检出相应克隆； 通常构建核酸探针，要求了解其基因序列或表达产物（蛋白质）的信息。 寡聚核苷酸探针 抗体探针 平板杂交筛选 克隆DNA转移到尼龙膜上；膜上的DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定。 酵母双杂交 很多真