[生物学]基因工程 载体构建.pptVIP

植物表达载体构建 ; 1974年Zeazen等从根癌农杆菌中分离出一巨大质粒, 称为致瘤质粒（Tumor inducing plasmid）,简称Ti质粒。在发根农杆菌中则存在Ri质粒(Root inducing plasmid)。随后在Ri或Ti质粒上发现有可整合到植物基因组中的农杆菌质粒DNA片段, 命名为转移DNA（Transfer DNA）, 简称T-DNA。; 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。 它是利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti (Tumer induce)质粒和发根农杆菌(Agrobaterium rhizogenis)的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。迄今所获得的转基因植物中80％以上是利用根癌农杆菌转化系统产生的。;根癌农杆菌（Ti质粒）;1) Ti 质粒类型（由Ti 质粒所产??的冠瘿碱种类而定） i. 章鱼碱类(octopine) ii. 胭脂碱类(nopaline) iii.农碱类(agropine) 2) Ti 质粒的结构 i. 环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区 i) 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素 ii) 冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成 iii) 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解 iv) Ti 质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移 v) 毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体 vi) DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制;;载体特点 载体种类 Gateway 技术 引物设计 ;1. 植物表达载体特点;左右边界序列 左边界序列和右边界序列对于农杆菌介导的转化是必需的，有利于T-DNA整合入植物的基因组，对于基因枪等方法可有可无。 ;共整合载体系统 共整合载体系统包括Ti质粒（200-500kb）和中间载体两部分.通过三亲交配法使克隆在中间载体上的外源基因从大肠杆菌进入农杆菌中,中间载体与改造的Ti质粒之间通过同源重组使外源基因整合到T-DNA区.当T-DNA左右边界序列之间的激素合成基因完全缺失,就能在实验室中再生转基因植株。 双元载体系统 双元系统中的农杆菌质粒是一个经过改造的Ti质粒,具有Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA),但没有T-DNA边界序列。例如LBA4404菌系含有一个缺失T-DNA区的pAL4404质粒。同时，农杆菌内还存在另外一个质粒，即双元穿梭载体 ，或称为微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，此质粒含有T-DNA区，能自我复制。Ti质粒上的Vir基因与穿梭质粒上的右边界序列发生反式相互作用,从而将T-DNA转移进入植物基因组 。双元载体向农杆菌的转化效率比Ti质粒高10000倍。; 按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个以上的质粒。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制, 而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制 。;不同复制类型质粒的比较 A, T载体; 1ul loading, Promega Kit. B, PCAMBIA-1303; 1ul loading, Promega Kit. C, pUCD, 5ul loading, Promega Kit . D, pROK2, 5ul loading, 博大泰克。;2. 载 体 种类;;pBI121;如何利用BioEdit绘图？;attR2,ccdB,CmR, attR1orientation= WG pnos-kan-tnos= K;GUS+GFP fusion protein;pROK2;;;;;;;pK7GIWG2;;No start codon for GusA;C-terminal gfp fusion;N-terminal gfp fusion;N, C-terminal gfp fusion;对照（荧光）;质壁分离 （荧光）;(A); （荧光）;;3. Gateway 技术;?? Gateway?技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统。这项强大的体外技术大