三氧化二砷对细胞周期素B2基因转录水平的上调作用-论文.pdfVIP

三氧化二砷对细胞周期素B2 基因转录水平的 上调作用1 1 1 2 2 吴顺华 ，郑玉建 ，成军 ，郭江 1 新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐 (830054) 2 北京地坛医院传染病研究所，北京 (100011) E-mail：wushunhua@126.com 摘 要：目的探讨三氧化二砷对细胞周期素B2 (cyclin B2)启动子转录水平的调节. 方法 据 文献确定cyclin B2 的启动子区域，聚合酶链反应（PCR ）扩增cyclin B2p ，克隆至真核报告 载体pCAT3-Basic 中，构建pCAT3-cyclin B2p 报告载体；以该质粒转染肝癌细胞系HepG2 细胞系，用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT ）的表达活性；并以不 同浓度的三氧化二砷刺激HepG2 细胞系，用ELISA 法检测CAT 的表达活性.结果 获得cyclin B2 启动子的正确克隆. 三氧化二砷（10 µMol/L ）刺激pCAT3-cyclin B2p 瞬时转染HepG2 细胞后报告基因CAT 表达的活性是pCAT3-Basic 空载体的5.84 倍，是pCAT3-cyclin B2p 的 1.95 倍.结论cyclin B2 启动子有顺式激活下游基因表达的活性，三氧化二砷对肝HepG2 细胞 cyclin B2 基因有上调作用. 关键词：三氧化二砷，cyclin B2 基因启动子，上调 中图分类号：R733.4 1. 引 言 三氧化二砷(arsenic trioxide , As2O3)是常见的一类无机砷化合物，近年来研究表明三氧 化二砷在体外对人的肝癌细胞株有抑制增殖、诱导凋亡的作用[1] 。但无机砷同时作为国际 癌症研究机构（IARC ）1980年确定一种致癌物，在环境中广泛存在并威胁人民健康和制约 经济发展[2] 。目前研究表明，三氧化二砷具有治/致癌双向调节机制，但详细的分子机制尚未 阐明[2] 。细胞周期及其调控机制的研究长期以来一直是生命科学领域中的热点。细胞周期的 紊乱将导致细胞功能异常改变，而参与细胞周期运行的有关因子如蛋白质及其基因等的异常 变化是导致细胞发生突变的基本机制，肿瘤的发生和发展过程与这类基因密切相关[3 ,4 ] 。因 此本项研究从细胞转录水平探讨三氧化二砷对细胞周期素B2基因表达的调节，采用分子克 隆技术构建细胞周期素B2基因启动子的真核报告载体，并以不同浓度的三氧化二砷刺激肝 HepG2细胞，检测报告基因CAT的活性表达情况，为深入研究三氧化二砷在肝细胞内的调节 作用机制提供理论依据。 2. 材料和方法 2.1 主要实验材料和试剂 三氧化二砷（分析纯）购于北京化学试剂三厂，人肝母细胞瘤细胞系 HepG2 细胞及大 肠杆菌 DH5α 菌株为本室保存 Tag DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶及限制性内切酶均购自 Takara 公司.质粒 DNA 提取试剂盒，中间载体pGEM-Teasy 及报告质粒 pCAT3-Basic 均购自 Promega 公司；CAT-ELISA 检测试剂盒及质粒 DNA 转染试剂盒购自 Roche 公司. 玻璃奶纯 化试剂盒购自博大公司. 其它生化试剂购自 Sigma 公司。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助（20040760002 ）和国家自然科学基金（ 的资助。 - 1 - 2.2 cyclin B2 启动子及聚合酶链反应扩增 [5] 根据Wasner等 公布的cyclin B2基因启动子序列及其引物，设计并由上海生工公司合 成引物，在上下游引物的5’-端分别加上Kpn I和Bgl II.