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PCR常见问题、原因分析及其对策 北京天为时代科技有限公司 PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 PCR常见问题之一 无扩增产物 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 现象：正对照有条带，而样品则无； PCR常见问题之二 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 PCR常见问题之二 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 原因 对 策 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 非特异性扩增 PCR常见问题之三 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M 1 2 PCR常见问题之三 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 拖尾 策略之一 巢式PCR（Nest-PCR） P1 P2 P3 P4 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。 * *