(精选)PCR抑制剂和增强剂教学课件.pptVIP

PCR抑制剂和增强剂 PCR抑制剂 SDS 苯酚 乙醇 异丙醇 乙酸钠 氯化钠 EDTA 血红素（heme） hemin（氯高铁血红素） tannic acids（丹宁酸） 肝素 尿素 二甲苯胺 溴芬兰 腐殖质 植物多糖 聚苯乙烯、聚丙烯 铁离子 bilirubin（胆红素） 胆酸盐 抑制剂来源 抑制剂 来源 胆酸盐 粪便 复杂多糖 粪便，植物材料 胶原质 组织 血红素（heme） 血液 腐植酸 土壤，植物材料，自然界水 黑色素 头发，皮肤 尿素 尿 血色素hemoglobin 血液 靛青染料 粗斜纹棉布 聚苯乙烯，聚丙烯 紫外线照射塑料管 蛋白酶 牛奶 钙离子 牛奶，骨头 抑制剂的作用浓度 SDS 离子去污剂 ，蛋白变性，0.01%即可完全抑制PCR反应，0.005%可显著降低产量 苯酚 蛋白变性，0.5%即可完全抑制PCR反应，0.2%可显著降低产量 乙醇 大于1%的浓度可抑制PCR反应，但在某些系统中可增加产量。 异丙醇 抑制作用比乙醇稍强 乙酸钠 大于5mM时抑制PCR反应 氯化钠 大于25mM时抑制PCR反应 EDTA 0.5mM可使PCR产物减少，1mM完全没有PCR产物。 血色素 1mg/ml 肝素 0.15I.U./ml 尿素 20mM（相当于10μl PCR体系中含0.6μl尿液） 氯高铁血红素 0.1ng/μl 丹宁酸 0.1ng/μl 例1：操作时温度不同产生的抑制剂 Shames等人（1995）使用PVP（polyvinylpyrollidone）在4℃分离粪便中的细菌DNA，然后用Chelex100处理。尽管用PVP在室温也可以分离DNA，但得到的DNA用于PCR扩增效果不够好，也许因为在更高的温度释放出了更多的PCR抑制剂。 例2：间接产生的抑制剂 Yoshii T等人1992年，用单根头发提取DNA扩增线粒体DNA一段333bp的非编码区。 所有实验均截取5cm长的毛干 后研究表明染色剂中的过氧化氢可以使不溶于水的黑色素变成水溶性的。 头发种类 截取毛干区域 扩增成功率 自然黑发 离根部11cm内 100% 离根部11cm外 部分成功 离根部16cm外 几乎不成功 白头发 离根部31cm外 可成功 染成深咖啡色的黑头发 完全失败 染成深咖啡色的白头发 可成功扩增 PCR增强剂 PCR增强剂可以增加所需PCR产物的产量或减少非特异性产物。有许多的PCR增强剂，原理各不相同，这些试剂不可能对所有的PCR反应都起作用。 根据其作用和原理，可以大致分为三类： 1.用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板（共溶剂） 2.用于保护DNA聚合酶的活性和稳定性 3.用于优化引物和模板的结合 1.用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板的增强剂 甜菜碱（betaine），二甲基亚枫（DMSO）和甲酰胺（formamide），甘油，适合于扩增高GC含量和形成复杂二级结构的模板。 甜菜碱1M、DMSO1-10％（5%？）、甲酰胺1-5％、甘油1％-10％对某些反应可以显著提高产量，但过量的这些试剂会抑制PCR反应。 4.其它增强剂 PEG 亚精胺 单链DNA结合蛋白 例：Relief of Amplification Inhibition in PCR with Bovine Serum Albumin or T4 Gene 32 Protein 已知抑制剂： EDTA,SDS,Triton X-100，hemin（氯高铁血红素），bilirubin（胆红素），sodium glycocholate (甘胆酸钠)，sodium cholate plus deoxycholate（脱氧胆酸钠），sodium taurocholate,（牛黄胆酸钠），tannic acids（丹宁酸），humic acid(腐植酸)，氯化铁，氯化钠，采自泥炭和Suwannee河的腐植酸和fulvic acid(棕黄酸) PCR反应：扩增Bacteroides distasonis基因组 消除腐植酸抑制作用的最优BSA浓度是200-400ng/μl，最优gp32浓度是100-150ng/μl 因此，所有已知的抑制剂在检测时，都同时做了不含BSA和gp32的检测和含有400ng/μl BSA或150ng/μl gp32的检测。 抑制水平的定义：通过琼脂糖电泳观察，能够可重复性的降低PCR产量的最低抑制剂浓度。 不添加任何增强剂 PCR体系中加入400ng/μl BSA