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PCR技术简介 PCR技术简介-定义 PCR: polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条DNA链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，快速特异地扩增出特定的DNA片断。 简单的讲， PCR技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。 PCR技术简介-目的 目的： 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片断。 由于PCR技术具有简单、快速、特异和灵敏的特点，所以自1985年Mullis发明PCR技术和1988年Erlich发现耐高温的DNA聚合酶以来，该技术以惊人的速度广泛应用于生命科学的各个领域，特别是在细胞学、病毒学、肿瘤学、遗传病学、法医学、动植物免疫学等方面取得了巨大的成绩，成为当代分子生物学发展史上的一个里程碑。 PCR技术简介-原理 设计两段寡核苷酸引物，这两段寡核苷酸引物序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列由分别位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，首先在摩尔数大大过量的两段引物及四种dNTP参与下对模板DNA进行加热变性；随之，将反应混合液冷却到某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列退火；此后退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成这一循环。由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这一周而复始的过程中每完成一个循环，就基本上使目的DNA产物增加一倍。这一指数反应的主产物是一段双链DNA，它的两个末端由寡核苷酸引物的5`端来决定，而长度则取决于两引物间的距离。 PCR技术简介 PCR反应所用酶： 早期的PCR方法采用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片断催化退火的寡核苷酸引物进行延伸反应。由于该酶会在进行DNA变性的温度下失活，所以在每一轮合成反应中都须重新加1份酶。并且在扩增较长模板是效果不够理想，产率较低，有一些错配，导致产物大小不均一。 耐热DNA聚合酶是从一种嗜热细菌－嗜热水生菌种提纯出来的，经95℃持续温育仍有活性，不会在加热变性中失活，故无需每轮反应都重新加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和变性可以在更高温度下进行，使引物和模板间的误配大大减少，提高了扩增反应的特异性和产率，并且可以扩增更长的产物。 PCR技术简介 反应体系: 按照以下次序，将各充分在灭菌离心管中混合， 灭菌水 ? μl MgCl2溶液 (25mmol/L) 6-8-10ul 1.5-2.0-2.5mmol/L 10×扩增缓冲液 10μl 4种dNTP混合物（2.5mmol/L） 8ul（？） 20mmol 正向引物（25 pmol/ul，超纯水配制）4ul 100pmol 反向引物（25pmol/ul，超纯水配制） 4ul 100pmol DNA Taq聚合酶 0.5μl 2.5U 模板DNA 1ul 1μg 总体积 100ul PCR技术简介 典型的反应条件: 循环 变性 退火 聚合 首轮循环 94 ~95℃5分钟 50℃2分钟 72℃2分钟 后续循环 94~95℃1分钟 50℃2分钟 72℃2分钟 末轮循环 94~95℃1分钟 50℃2分钟 72℃10分钟 PCR技术简介 DNA近似分子量计算： MW=总碱基数×324.5(DNA中每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5) ?例： 若你得到1管5 OD260×的引物DNA,引物长度为20个碱基，则MW=20×324.5=6490 质量数=5×33=165ug 摩尔数=165/6490=0.025umol=25nmol 若要稀释到25pmol/ul,即25nmol/ml,则需要加1ml的双蒸灭菌水稀释。 PCR技术简介 设计程序中用到的温度： 变性