(精选)PCR技术的原理及应用教学课件.pptVIP

实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 C(t) value 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: lg X0= - Ct× lg(1+Ex) + lg M (3) Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。 实时荧光定量PCR 原理 --------- 标准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 Sample 实时荧光定量PCR原理 绝对定量 25 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green Ⅰ 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor 实时荧光定量PCR 原理 --- DNA 产物的荧光标记 Q Q R 实时荧光定量PCR 方法 1 －－－SYBR GreenⅠ 法 SYBR Green Ⅰ法 SYBR GreenⅠ 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green Ⅰ 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR GreenⅠ 发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。 SYBR Green 实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理 5’ 3’ 5’ 3’ SG No Emission SG SG SG Excitation SG SG SG SG SG SG SG 5’ 3’ 5’ 3’ Emission Excitation 实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析 温度 荧光强度 Tm Tm值：DNA解链一半时的温度 实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析 将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT) -dI dT Tm SYBR Green Ⅰ法 融解曲线分析 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，有杂峰 其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 非特异性产物 Cycle number Flourescenc 104 102 Sample Cycle nu