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靶序列或扩增产物 的交叉污染 原因 开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外 更换试剂、耗材 试剂分装，贮存适当。 更换实验室和所有试剂耗材。 假阳性 　现象：空白对照出现目的扩增产物 对策 PCR中应注意的事项 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分 Real-time PCR技术介绍 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR 原理 实时原理 常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR原理 定量原理 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）； 纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value 宁夏疾控中心病毒科 马江涛 分子生物学实验原理与常见问题解答 RNA提取原理与注意事项 PCR原理与常见问题 Real-time PCR介绍 内容 商品化提取试剂盒原理： 异硫氰酸胍（GIT）-酚法 GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA； GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；一定条件下（各家试剂条件不同），RNA不溶于乙醇，而DNA和蛋白质溶于乙醇溶液，通过滤柱时，RNA挂柱， DNA和蛋白质溶于滤液；在逐步洗脱的过程中，RNA不断被纯化；最后用水洗脱。 杜绝外源酶的污染： 严格戴好帽子，口罩，手套。 实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 RNA提取的注意事项 （外界环境中多含Rnase，且RNA极不稳定） RNase free DNase free 阻止内源酶的活性： 选择合适的匀浆方法。 选择合适的裂解液。 控制好样品的起始量。 PCR技术的基本原理 模板DNA的变性：93℃-95℃左右， 模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5 ℃ 引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性 变性--退火--延伸三个步骤 引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值-（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） PCR的基本原理 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 模板DNA 95℃ PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 引物