流式细胞分选服务注意事项.docVIP

浙江大学医学部公共支撑技术平台 ——流式细胞分选服务预约注意事项 一、服务项目 无菌细胞分选: 各种细胞系、原代细胞、肿瘤组织单细胞悬液等； 特殊细胞分选或其他项目：请联系管理员黄莹莹（risa929@126.com; 057188981952）； 本仪器以分选为主，不承接流式分析实验，建议事先使用其它流式细胞仪确认细胞阳性染色比例。如特殊情况确需本仪器分析的，请联系管理员。 二、特别注意 安全性问题：由于在分选过程中，样本可能通过液滴震荡产生气溶胶，所以不接受会传播人类病原菌的生物有害样本，也不接受含放射性生物样品。 应知道细胞的大小与形态，以便选择分选用喷嘴。所分选细胞的直径最好小于喷嘴直径的1/5，至少小于1/3。细胞的形态也会影响了分选的结果，理论上越接近于球形的细胞，分选过程中的剪切力对细胞造成的伤害就越小。形态特殊的细胞应选择较大的喷嘴，以减轻分选过程对细胞造成的伤害。 各种细胞的建议浓度和所用喷嘴如下表。 Table 1 细胞种类和浓度、喷嘴的选择 细胞种类 浓度 喷嘴 Lymphocytes, thymocytes or?splenocytes (直径8-12 μm) 8 - 12 × 106 /ml 70μm Activated lymphocytes, smaller cell lines (直径12-20 μm) 7- 9 × 106 /ml 85 μm Large adherent cell line (直径20 μm) 5 - 8 × 106 /ml 100μm 荧光染料的选择：如选择1到4个荧光标记，一般按如下顺序选择，FITC、PE、APC和PerCP。 三、样本制备 样本制备基本流程： 获取细胞悬液→荧光抗体染色→调整细胞浓度（参考Table 1）→过滤细胞→移入流式管→避光置冰上运至分选室→上机检测并设定分选条件→分选细胞→上机回测，检测纯度。 注：分选前的细胞一定要过滤过（一般用300目滤网），否则会堵机器的。 分选所用的细胞染色方法与分析所用方法基本相同，但需要注意以下几点： 保证样本的无菌状态，因为分选得到的细胞还要继续培养； 不能使用固定剂固定细胞，因为活细胞经固定剂处理后即死亡； 保证上机样品为单细胞悬液； 准备充足的细胞，详见Table 1； 建议分选上样管中的缓冲液使用含2% FBS的PBS，普通培养基中的酚红可能会干扰分选；若用培养基的话，颜色不能太深，血清浓度不能超过2%，否则粘性太大影响分选。 如细胞分选后需再次培养，请准备含血清的收集管，在分选前交操作员。建议在5ml离心管中加入1-2ml血清及其它必需组分，保证分选完毕时血清浓度大于5%； 如要分选GFP等转染的样品，请提供未经转染的相同细胞为阴性对照； 如要做多重荧光染色标本的分选，请提供各种单一荧光染色的标本； 如要去除死细胞，在不影响后续实验前提下，可以加入7-AAD或是PI； 快速简便的样本处理有利于分选：处理好的样本尽快上机，分选好的细胞尽快下一步实验，如果要分选多个样本，建议一次处理一个，估计可能的上机时间后，再处理第二个样本。 四.常见问题 Q1. 上机样品需要溶在何种溶液中？是否可以就直接放在原本培养的培养基中？ Ans: 建议不要放培养基中，因为Phenol Red可能会影响分选的结果，可先尝试使用含2%FBS 或BSA的PBS作为分选缓冲液。如要求更好的细胞存活率，按分选细胞的不同，选择不同的分选缓冲液。 淋巴细胞（HBSS配方中的阳离子可增进细胞的生存力。如果这些细胞并非易于群集细胞，可以选用没有EDTA的缓冲液）。 1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca2+ and Mg2+) 1× HBSS (without phenol red) with 1% BSA 0.5% - 2% BSA in PBS(without Ca2+ and Mg2+) 贴壁细胞（以Trypsin处理后去准备单细胞悬浮液时，待细胞变圆(切记不可过度作用)，以适量含5%血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬浮液。离心后，用分选缓冲液调整细胞浓度。如果需要的话可以提高EDTA的浓度(至5mM)以避免细胞重新黏聚）。 5 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca2+ and Mg2+) 0.5-2% BSA in PBS(without Ca2+ and Mg2+) 含有高比例死细胞的样本（这些配方可减少因死细胞释放出来的DNA所造成的细胞黏聚现象。） 5mM MgCl2, 1 mM EDTA, 25mM He