试验三、转氨酶活力测定.pptVIP

* * 实验三、 氨基移换反应 －血液中转氨酶活力的测定 指在转氨酶催化下将?-氨基酸的氨基转给另一个?-酮酸，生成相应的?-酮酸和一种新的?-氨基酸的过程,也称氨基移换作用。 转氨作用 一．实验原理 血清中的谷-丙转氨酶，在37℃、pH7.4的条件下，可催化丙氨酸与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸 丙酮酸可与2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，该产物在碱性环境中可转化成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅与丙酮酸的生成量，亦即与谷丙转氨酶活性的高低成正比。通过标准曲线可以查出丙酮酸的生成量。 * 仪器 1. 5×15cm试管、刻度吸量管。 2. 恒温水浴、离心机、721型分光光度计。 * 试剂 1.0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液 ⑴0.1mol/L磷酸氢二钠溶液 ⑵0.1mol/L磷酸二氢钾溶液 ⑶ 0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。 （两者以4：1体积比混合） 三、仪器与试剂 2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL） 3.谷-丙转氨酶底物溶液 (含α-酮戊二酸2 μmol/ml及DL-丙氨酸200 μmol/ml) 4. 2.4二硝基苯肼溶液 (0.02%,1mol/L HCl溶液) 5. 0.4mol/L NaOH溶液 。 四、实验操作 1、标准曲线制作： 1）、取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5编号。先将试管置于37℃恒温水浴中保温5分钟以平衡内外温度。然后按下表所列的次序添加各试剂。 2）、向各管内加入0.5毫升2,4-二硝基苯肼溶液，37℃保温15分钟，接着分别向各管内加入0.4M氢氧化钠溶液5毫升。再37℃保温15分钟，以0号管作空白对照，测定520 nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。 2、血清样品谷丙转氨酶活性的测定 1）、取3支试管，分别标上空白、样品1、样品2。向各管内加入0.5 mL谷丙转氨酶底物、0.1 mL磷酸缓冲溶液并摇匀，37℃水浴保温5分钟。 2）、向样品管中分别加入0.1 mL血清，37℃保温30分钟。 3）、向空白与样品管中分别加入0.5 mL 2，4－二硝基苯肼，摇匀，水浴保温15分钟。 4）、向空白管中加入0.1 mL血清，摇匀。 5）、向所以3支试管中都加入5.0 mL 0.4 M NaOH溶液，摇匀并水浴保温15分钟后在520 nm进行比色测定。 保温30分钟 五、实验结果 1、用测定吸光值在标准曲线上查出丙酮酸的生成量 2、计算： 丙酮酸物质的量（μmol） 谷丙转氨酶活性单位/100mL= ×1000 时间（min） 国际单位：在最适温度下，1分钟内转化1μmol底物的酶量称为1个酶单位（U）。 Katal单位：在一定条件下，1秒钟内转化1mol底物所需要的酶量。 1 U＝16.67 nKat 1 Kat ＝6 ? 107 U 六、酶活力单位的定义 1. 在测定谷丙转氨酶活力时，应事先将底物、血清在37℃水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2.转氨酶只能作用于α-L-氨基酸，对D-氨基酸无作用。实验室多用α-DL-氨基酸。 3. 进行样品测定时，加入2,4-二硝基苯肼溶液后要摇匀并保温15分钟。 4. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。 七、注意事项