次元电气泳动.PPT

補足：分子量の求め方 SDS－PAGEの泳動像から分子量を推定するには？ SDSの分子量マーカーに使用される代表的なタンパク質 分子量算出の手順～バンドが綺麗に揃ったゲルの場合～ 分子量算出の手順～スマイリングしたゲルや別のゲルで比較する場合～ SDSで分子量を測定する上での注意点 * タンパク質のバンドの移動距離を、分子量が既知のタンパク質の ものと比較することで、目的のタンパク質の分子量を算出できる 同じゲルの中で既知のタンパク質（分子量マーカー）を泳動する 分子量マーカーのバンドの移動距離を測り、分子量と対応する 移動距離を片対グラフにプロットする これを検量線として目的のバンドの移動距離から分子量を求める １）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの 移動距離を正確にはかる 分子量マーカー サンプル 44.6mm 33.5 23.6 12 .7 6.7 3.6 ２）片対グラフの横軸（普通目盛）に移動距離、縦軸（対数目盛）に分子量　　をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする ３）移動度－分子量標準曲線を求める ４）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる ５）その数値を３）で求めた標準曲線の式（y＝267249ｘ－0.7341）に代入し 　 分子量を算出する 分子量マーカー サンプル 28.5mm 267249×28.5 －0.7341＝22851.49 求めるタンパクの分子量 １）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの 移動距離を正確にはかる ２）レーンの同じ場所で泳動のフロントラインの移動距離を正確にはかる 分子量マーカー サンプル BPB 分子量マーカー サンプル ３）フロントラインの移動距離を１として、それぞれの分子量マーカーのバン　　ドの移動距離の相対値（＝相対移動度：Rf値）を計算する 0.25 0.67 1.0 ４）片対グラフの横軸（普通目盛）にＲｆ値、縦軸（対数目盛）に分子量を とり 、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする ５）Rf値－分子量標準曲線を求める ７）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる ８）そのサンプルが流れているレーンの同じ場所で、泳動のフロントライン　 　 の移動距離をはかる ９）フロントラインの移動距離を１として、目的のタンパク質のＲｆ値を計算し 　 ５）で求めた標準曲線の式（y=15154x－0. 7425）に代入すると、分子量が 　 算出できる 分子量マーカー サンプル 0.57 1.0 15154×0.57 －0.7425＝22771.73 求めるタンパクの分子量 二次元電気泳動での分子量マーカーの使い方 分子量マーカー のバンド ?塩基性に富んだタンパク質はSDSの結合量が少なくなるため、移動度が 小さくなる＝見かけの分子量が大きくなる ?タンパク分子内に疎水性に富んだ部分が多い場合は、SDSの結合量も 　多くなり、移動度が大きくなる＝見かけの分子量が小さくなる ?糖タンパク質や酸性タンパク質はSDSの結合量が少なく、移動度も小さい 　＝見かけの分子量が大きくなる ?多量体やサブユニット構造をとっているタンパク質分子では、SDSで わかるのはその単一ポリペプチドの分子量だけで、その分子が生体内で 機能している状態の分子量はわからない 　　 　　　例）　　免疫グロブリン＝重鎖2本と軽鎖2本がS-S結合した構造をもつ S-S結合の切断により約50kDaのバンドと約22kDaのバンドがそれぞれ現れる 免疫グロブリンの構造 黄色い部分＝Light chain 　　　　　　　　　　　　　（L鎖） 緑色の部分＝Heavy chain 　　 　　　　　　　　　　（H鎖） 2本のL鎖と2本のH鎖で 構成されている L鎖とH鎖、H鎖とH鎖同士はS-S結合で結ばれている 前回、前々回と二次元電気泳動の基本について勉強しました。 今回はその補足として、SDSの泳動像からどうやって目的とするタンパク質の分子量を算出するのか、具体的な手順について説明したいと思います。 SDS－PAGEの分子量マーカーとして使用される代表的なタンパク質を表にしてみました。 先ほど説明したように、既知の分子量を持つタンパク質を数種類混ぜ合わせたものが分子量マーカーです。 ここにあるのは一例ですが、同じ由来の同じタンパク質でもメーカーによって分子量が違う場合があるので注意が必要です。 市販の分子量マーカーは低分子用、高分子用、広範囲用に混合されているので、その中から自分の目的のタンパク質にふさわしい分子量マーカーを選ぶことが大事です。 例えば、低分子