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几种核酸杂交实验和原理步骤以及几种技术特点比较 本文主要简单阐述了southern杂交、Northern杂交、原位杂交、点杂交这几种核酸杂交方法的异同点。并介绍了点杂交的基本概念及实验原理、方法。 （1）几种核酸杂交的异同点 核酸杂交是分子生物学的基本技术，也是遗传学研究和基因诊断的常用方法。核酸杂交的形式有多种，其中最常用的是Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、点杂交等。虽然形式多样，但都是基于核酸分子的碱基互补原理。从杂交材料来看，杂交分为DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。从杂交分子状态来看，杂交分为液相-固相杂交和液相-液相杂交。 上述几种杂交都属于液相-固相杂交，即将参与杂交的一方分子固定在固相的支持载体上，另一方分子以液相形式参与杂交。参与杂交的双方分子必有一方被标记，以便产生能够被检出的杂交信号;在液相-固相杂交中往往液相分子被标记，这样才能产生有意义的差别信号。在杂交在中，被标记的分子称为探针，而与探针进行杂交的分子称为被检测样品(被检分子)。大多数液相-固相杂交中被检样品往往是混合分子，如提取的基因组DNA或某种组织的RNA，并且将被检样品固定在载体上，而探针往往是单一分子，如某一基因的片断。杂交结果是根据信号的强弱和位置进行判断，如被检分子的分子量(或长度)，被检分子的表达强度等。这种杂交适用于相同基因片断对不同样品的检测。若进行一种样品被不同基因片断的检测时，就必须采取反向的方式，即将不同的基因片断固定在载体上，而将被检样品制成液相并进行标记。这种反向的方式称为反向杂交，反向杂交中被标记的样品也可以称为探针。 在液相-固相杂交中固相载体往往采用尼龙膜或醋酸纤维膜，这些经过特殊处理的材料对核酸分子具有强大的吸附力，在操作中不易脱落。探针标记往往采用放射性标记，如32P、35S等，由于放射性物质的危害性，现在非放射性标记也在广泛使用，如生物素标记、地高辛标记等。一般来说，放射性标记适用于Southern杂交、Northern杂交和点杂交，非放射性标记适用于原位杂交。放射性标记灵敏度高，线形范围宽，非放射性标记定位性强，没有衰变，危害小。 （2）点杂交的概念 点杂交(dot blot)是杂交信号呈现斑点样的杂交方法，在操作上是把参与杂交的一方分子点样到膜上。由于杂交分子预先没有进行像Southern杂交和Northern杂交之前的电泳分离，也没有像原位杂交那样，杂交一方的分子已经表现出组织细胞分布的位置特异性，所以点杂交的结果判断完全视杂交信号的强弱，其信息量没有其它杂交形式的信息量丰富。但点杂交的操作比较简单、结果直观、适用于大批样品的检测，因此它在许多方面也得到了广泛的应用。 一、实验目的 理解核酸杂交原理;熟悉核酸杂交的一般方法，掌握膜斑点杂交技术和结果分析。 二、实验原理 点杂交是核酸杂交中比较简单的一种技术，本质上也是单链核酸分子通过碱基互补而形成双链核酸的过程，当某单链分子被标记后，就可以检测与其互补的分子。 (一)印迹 印迹(blot)就是将杂交一方的分子固定在膜上，对于Southern杂交和Northern杂交，往往采用毛细转移，真空转移或电转移等方法，使电泳分离的核酸分子“原位印迹”到膜上去，而点杂交则可采取人工点样的方法，将核酸分子固定到膜上去。在点膜时还要借助其它使核酸分子固定的方法(如点膜器、真空抽气装置)使分子更紧密地结合在膜上，并且不扩散。点杂交的印迹过程提供了一个固化平台和阵列，使杂交在已知位置上进行。 (二)标记 标记(labeling )就是使参与杂交的一方分子带有可识别的物质，使杂交后显示信号。常用标记物有放射性同位素和非放射性物质，标记方法有随机引物标记法、缺口平移法和末端标记法等。在液相-固相杂交中，标记往往在液相分子上，使探针成为流动相。标记效率是影响杂交的重要因素，在一定范围内，比活性(可以理解为单位分子中的标记物数量与活性)越高越好。在杂交中，探针往往是过量的(杂交信号的强弱反映的是被检样品的量和基因丰度)，所以依靠增加探针量来提高杂交灵敏度的做法很有限的，应该提高探针的比活性。