高级_生化课件生物化学技术讲解原理与应用.ppt

特点：高通量、微型化、易操作。 适用于：蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-小分子物质间相互作用的分析，是功能基因组、蛋白组研究领域中一种新型的重要工具。 随后在蛋白质芯片基础上又衍生出细胞/组织芯片，即将细胞/组织切片固定于滤膜等载体上，利用抗体免疫组织化学、原位杂交等方法进行高通量并行分析，在此基础上建立各种细胞/组织的分子谱。 二、制备与操作 蛋白质芯片工作流程包括芯片制备、待测样品处理、杂交反应、洗涤、信号检测和数据分析等步骤。 制备蛋白质芯片的方法主要有3种：共价键结合法、凝胶垫结合法、吸附固定法。 三、应用实例 1.分析蛋白质功能 2.建立蛋白质谱与诊断疾病 （1）蛋白质-蛋白质相互作用 （2）酶与底物相互作用 （3）蛋白质与小分子物质间的相互作用 （4）分析几基因表达与筛选抗体 第三节 芯片实验室 芯片实验室由进样系统，样品过滤和 抽提系统，阀系统，电泳系统，低、高密度芯片和检测系统等组成。 操作程序： （1）样品处理 （2）生物化学反应 （3）结果检测 第十五章 聚合酶链反应 第一节 基本原理 第二节 PCR的类型 第三节 应用 第一节 基本原理 PCR是由引物介导，聚合酶催化底物，在体外进行特异扩增的一种方法。该方法全过程分三步：①变性 ②退火 ③延伸 一、反应系统 二、反应过程及条件 一、反应系统 1.TaqDNA聚合酶 2.模板 3.引物 4.底物 5.缓冲液 TaqDNA聚合酶的最适温度为75-80℃，合成速率约为150个核苷酸/s每个酶分子，即使在70℃，延伸速率可达60个核苷酸以上。 PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。模板来源：培养的细胞、细菌、病毒和组织中等提取，也可以从收集的病理样品和考古标本等获得。 PCR有两种引物：5’端引物和3’端引物。 引物设计原则： （1）引物长度：一般16-36bp； （2）G+C含量：40%-60%； （3）碱基分布：4种碱基随机分布，嘌呤和嘧啶不要有3个以上连续排列； （4）引物自身不含互补序列； （5）两个引物之间的同源碱基4个； （6）引物与非特异性靶区之间的同源性要70%或者连续互补同源碱基8%； （7）引物3’端是引发延伸点，不能错配； （8）引物5’端可以修饰。 dNTP为PCR合成DNA的底物，各种dNTP浓度相同，一般浓度的范围为20-200umol/L。浓度过高容易发生渗入错误；浓度过低，反应速度较慢。 Tris-HCL缓冲液可以稳定pH值，KCL有利于引物退火，而DTT与Tween20则可以保护Taq聚合酶的催化活性，Mg2+浓度可以直接影响反应的特异性和产率。 二、反应过程及条件 普通PCR反应过程及条件： 变性 94℃ 5min 变性 94℃ 30s 复性 45-65℃ 30s 25-35个循环 延伸 72℃ 45s-8min 最后一次延伸72℃ 7min 保存 4℃ 第二节 PCR的类型 一、普通PCR 二、原位PCR 三、反转录PCR 四、反向PCR 五、不对称PCR 六、巢氏PCR 七、彩色PCR 八、Q-PCR 第三节 应用 一、构建cDNA文库 二、直接测序 三、标记DNA探针 四、寻找新基因 五、检测环境中的致病菌与指示菌 第十六章 细胞凋亡 凋亡(apoptosis)一词来自希腊语，apo指分离，ptosis指落下。凋亡的原意是枯萎的树叶或花瓣自然凋落。1972年澳大利亚昆士兰大学的kerr等人在许多组织中发现了一种散在的自发的细胞死亡现象，认为这是一种不同于细胞坏死的细胞生理性死亡，并首次提出了细胞凋亡的新概念。 细胞凋亡(apoptosis、APO)是由基因调控的主动而有序的细胞死亡，有人又称程序性细胞死亡(programmed cell,death，PCD)。但严格来说，细胞凋亡和程序性细胞死亡是有区别的，前者强调形态学变化(如染色质着边及DNA梯状条带等)，后者重视细胞功能改变，但目前一般统称为细胞凋亡。 细胞凋亡的生物学意义 ①清除无用的、多余的细胞。无用的细胞大多在发育早期阶段即发生凋亡。如果发育过程中某些细胞产生过多，也会发生凋亡。例如，人胚胎肢芽发育过程中指(趾)间组织，通过细胞凋亡机制被清除而形成指(趾)间隙。 ②清除受损、突变或衰老的细胞。受损不能修复的细胞通过凋亡而被清除。受病毒感染的细胞通过凋亡使DNA发生降解，整合于其中的病毒D