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HBV整合片段对人PCNA基因启动子的调控 33D一,5{5 第29卷第4期 1997年7月 生物化学与生物物理 ACTABlOCHIMICAetBIOPHYSICASIN1CA 7) V0ll29.No.4 July.i997 HBV整合片段对人PCNA基因 李明 启动子的调控 垒邱海英周翊钟陆长德 酣上悔化学矸究上悔¨ 摘要 f H7c是从一例肝癌组织中克隆得到的HBV整台片段,其中保留有preS2基因的启动子 及c端缺失的preS/S蛋白的阀读框架.我们用共转染方法研究了该整合片段对增殖细胞棱 抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)启动子的髟响.结果表明在HepG2细胞中, 含有上述HBV整合片段DNA的质粒pKSHTCHpal能以剂量依赖方式激活PCNA启动 子.对SV40启动子而言.PCNA启动子有1～2倍的更高激活.而破坏preS/S表达的两个亚 克隆pKSHTCHX和pKSH7c6H则投有转录激活活性.进一步用PCNA启动子的突 变体共转染研究发现PCNA启动子中转录起点上游45bp处的ATF位点在转录激活词控中 有重要作用.本研究首次报道了HBV整合片段对一参与DNA复制的蛋自因子启动子的调 口1:iHBV缺失p基因;ATF 增殖细胞核抗原是真核DNA聚合酶8的附属蛋白,在前导链的第一个冈崎片段合 成后,PCNA与另一个附属蛋白RF—C一起促使DNA聚合酶从引物末端解离并帮助 DNA聚合酶6结合上去进行DNA的合成]用专一针对PCNA的抗体或反义寡核苷酸 处理通透细胞可抑制细胞DNA的合成和细胞增殖口],另外PCNA可与Cyclin/CDK, E2F等细胞因子免疫共沉淀J,而且在细胞中专一切割PCNAmRNA的ribozyme的表 达可延迟HeLa细胞在血清刺激后进人S期的时间及DNA合成的速度,这些都说明 PCNA在细胞增殖中起着重要的作用.1989年,Travali等首先克隆了人PCNA基因. l990年,Morris等也报道了人PCNA基因启动子部分序列].我们实验室也从装在噬 菌体Charon30中的人基因库中筛选得到了一个含人PCNA基因的克隆-,该克隆有较 长的5上游区,因而可对其启动子部分调控开展研究. HBV是一种嗜肝DNA病毒,在80以上HBV相关的肝细胞癌患者的染色体上有 HBVDNA的整合,而其中80左右的整合DNA编码HBV的X或C端缺失的preS/S 蛋白,这两种蛋白能激活SV40,c—los和cmyc等启动子的转录,因而被认为在HBV相关 收稿日期:1996—0919;接受13期:1996—1202. 国家自然科学基金资助项目 , 一 第4期HBV整合片段对人PCNA基因启动子的词控331 的肝癌发生中有重要作用.还没有见到它对DNA复制的蛋白因子启动子的作用的报 道. HTC是周翊钟等从一侧肝癌组织中克隆得到的HBV整合片段,其中保留有preS2 基因的启动子及C端缺失的preS/S蛋白的阅读框架.鉴于PCNA在DNA复制及细胞 分裂中的重要作用,我们用共转染方法研究了该整合片段对PCNA启动子的影响. 材料和方法 1.1材料 人肝癌细胞株HepG2由本所汪垣教授提供.大肠杆菌菌株JM105,JMll0为本组保 存菌种.荧光素酶表达质粒pGL2一Basic购自Promega公司SV40启动子介导的p一半乳 糖苷酶表达质粒pSKll0由汪垣教授惠赠.插入有PCNA一538至+60bp的M13质粒 mpl9一PCNA由本组提供.PCR引物由本所DNA合成仪合成.各种内切酶,T4DNA连 接酶购自Promega公司,TaqDNA聚合酶购自Boehring—Mannheim公司.荧光素酶活 性测定试剂盒购自Promega公司,半乳糖苷酶活性测定试剂盒购自Clontech公司.在 自制的光子计数器上测定. 1.2方法 l_2.1pGL2Basic质粒改造及PCNA启动子介导的荧光索酶基因表达质粒的姐装 一 538bp至+6Obp的PCNA启动子被克隆在M13mpl9载体中,而在荧光素酶表达质 粒pGL一2Basic中无合适酶切位点,因此首先对pGL一2Basic载体进行了改造.根据 pUC18中LacZ基因的核苷酸顺亭,我们设计了一对PCR引物: GP25GGAATTGTGACA:GGATAAC3 GP55GCTATTACGCCACA:TGGC3 其中GP5含有Pvul的酶切位点(划线部分).以pUC18为模板,GP2及GP5为引 物,用PCR法扩增了pUC18中包括多克隆位点的一段序列然后用脚I和PvuI双酶 切,插入到pGL2一Basic载体的I,SmaI位点中得pGL2p18.经测序鉴定,结果表明 克隆正确(未给出). 克隆于M13mpl9中的