暨大酶与酶工程实验报告4.docxVIP

暨南大学本科实验报告专用纸课程名称 酶与酶工程实验 成绩评定 实验项目名称包埋法、交联法对细胞、酶的固定化及其比较 指导教师 李任强 实验项目编号 实验项目类型 实验地点 生物楼202 学生姓名 李金超 学号 20110518388 学院 生命科学技术学院 系 生物工程学系 专业 生物技术 实验时间2013年 月 日下午～ 月 日下午 温度 ℃湿度 1.实验目的1.1 通过用聚丙烯酰胺包埋法和明胶——戊二醛交联法两种方法固定枯草 杆菌菌体和细胞色素C；1.2 掌握细胞和酶的一些固定方法，并对它们进行固定效果的比较；1.3 了解上述这些固定方法的特点。2.实验原理 2.1 酶的固定的定义：酶的固定化技术是用物理或化学的方法将水溶性的酶与固态的水不溶性载体结合，使之成为一种不溶于水的仍具有酶活性的物质。固定化酶具有许多优点：可以反复使用；易与产物分离，便于产物的纯化处理，提高产物的产量和质量；多数情况下，比水溶性的酶稳定；适于装柱使用，有利于生产的连续化。2.2 细胞的固定的定义：细胞的固定是将产酶的微生物细胞直接固定在固态的水不溶性载体上，省去了细胞破碎以及酶提取等复杂的步骤。但要求所固定的微生物能让底物和产物易透过细胞膜并且细胞内不存在产物的分解系统。所以，要固定的细胞应该是有选择性的。2.3 丙烯酰胺和明胶固定酶或细胞的原理：丙烯酰胺在一定条件下经催化可形成凝胶，把酶或细胞包埋在凝胶的网络空隙中，形成不溶性的酶的载体。明胶是一种惰性蛋白，当与细胞或酶蛋白混合后，就把酶或细胞包埋在明胶联成的网架之中。由于菌体细胞或酶蛋白的表面都有蛋白质游离氨基，当加入双功能团试剂戊二醛以后，戊二醛即和蛋白质游离氨基形成Schiff碱，因此，在明胶表面与菌体或酶蛋白表面之间发生错综复杂的交联，从而使酶或细胞固定化。3.主要仪器与试剂 3.1 主要仪器： 灭菌锅，摇床，冰箱，离心机，水浴锅，紫外-可见分光光度计等。 3.2 材料与试剂：蛋白胨，牛肉膏，明胶，戊二醛，丙烯酰胺（Acr），过硫酸铵（AP），甲叉双丙烯酰胺（Bis），四甲基乙二胺（TEMED），过氧化氢，邻苯二胺，细胞色素C等。4.实验步骤 4.1 枯草杆菌细胞的培养在超净台上将已灭菌的培养液5ml移置已灭菌的试管中，接种纯的枯草芽孢杆菌。在37℃摇床快速振荡培养8-10小时（培养液较混浊为止）。离心收集菌体，加3ml蒸馏水轻搅使菌细胞悬浮。 4.2 丙烯酰胺凝胶固定细胞色素C和菌细胞 取50ml烧杯三只，各加入3ml 29%Acr-1%Bis混合液，2ml水。轻搅匀后，于1号烧杯中加入1ml菌细胞悬浮液、2号烧杯中加入1ml 0.13%细胞色素C液和在3号烧杯中加入水1ml作为对照，然后都加入10％过硫酸铵液70μl和TEMED8μl，轻搅匀后待凝。将凝固后的凝胶用水浸泡5分钟，其中换水3次。把凝胶放置滤纸上，用滤纸轻吸干，观察凝胶颜色。将这几种凝胶切成小颗粒，分别取约0.5克放置于有滤纸的漏斗中，用水淋洗数次后移置试管中，各加入20mmol/L邻苯二胺4ml浸泡2分钟后加入10%过氧化氢0.04ml，混匀反应5min，倒出上清液，以水为空白测定428nm处的吸光值，分析测定结果并解释。 4.3 明胶包埋—戊二醛交联法制备固定化细胞色素C和固定化菌细胞 取50ml烧杯二只，各加入明胶1克，水4ml，于80℃水浴熔化，冷却至60℃左右分别加入2ml菌细胞悬浮液或0.13%的细胞色素C液，在搅动下迅速加入25%的戊二醛0.5ml，凝结后，观察比较。 5.结果分析与讨论5.1 丙烯酰胺凝胶固定细胞色素C和菌细胞 图1：丙烯酰胺凝胶固定化细胞色素C和菌细胞含有菌细胞或细胞色素C的丙烯酰胺凝胶带有菌液或细胞色素C的颜色，而对照组呈无色透明状，这说明了菌细胞或细胞色素C已被成功包埋在了凝胶中。用丙烯酰胺凝胶固定化细胞色素C和菌细胞呈果冻状，柔软易碎，可以切成碎粒。丙烯酰胺凝胶凝结迅速，用此法进行酶或细胞的固定较简单易行。5.2 丙烯酰胺凝胶固定细胞色素C和菌细胞催化过氧化氢分解的能力Figure1：丙烯酰胺凝胶固定化细胞色素C和菌细胞的催化能力由figure1，丙烯酰胺凝胶凝固定化的菌细胞和细胞色素C这两组的OD428值比对照组大许多，这说明丙烯酰胺凝胶凝固定化的菌细胞和细胞色素C对过氧化氢具有一定的催化能力。但这种催化能力很弱，如细胞色素C这组的OD428最大也不超过0.1。原因可能是菌细胞或细胞色素C对过氧化氢的催化能力本身就不强，也可能是固定化过程损伤了菌细胞或细胞色素C的催化活力。在这里，菌细胞和细胞色素C对过氧化氢的催化能力孰强孰弱是没法比较的，尽管figure1显示细胞色素C催化产生的OD428吸收值比菌细胞的大。有同学认为细胞色素C与过氧化氢的接触面积相比菌