2012基因重组教学教材.ppt

重组DNA与基因工程;几个重要的专业名词;遗传工程(Genetic engineering )就是按人们的意思去改造生物的遗传特性、或创建具有新遗传物性的生物。 遗传工程广义包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分子水平上的操作，即重组DNA技术（有人称之为基因工程） 基因工程中最主要的工作是分子克隆（molecular cloning ）;分子克隆 所谓克隆，是指一个细胞经过无性繁殖以后所形成的子代群体。纯化繁殖DNA就称为DNA克隆（分子克隆） 分子克隆—制备DNA片段，在体外将目的基因与载体DNA结合成一个具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、获得大量同一DNA分子拷贝。 重组DNA技术←→分子克隆技术 分子克隆所采用的技术：重组DNA技术 ; 重组DNA技术流程;基本工程的基本程序 ;基因重组所必需的元素及过程;一、目的基因;;（二）、cDNA文库构建 提取组织细胞的总mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（噬菌体或质粒载体）连接后转化细菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。 ;;(三)、聚合酶链式反应（PCR） 如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR ），从基因组DNA或cDNA中获得目的基因，而不必要经过复杂的DNA文库构建过程。 ;　(四)、人工化学合成 现在计算机控制的全自动核酸合成仪已被广泛应用，按人们设计好的序列一次合成100-200bp长的DNA片段已不成问题。可用这些合成的片段组合连接成完整的基因。 ;载体是指能将外源DNA携带进入宿主细胞并进行扩增和表达的工具。 分离的基因和核酸序列自身不能繁殖，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。 基因工程载体一般要求: 　　①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。 　　②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。　;③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。 ④容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。 ⑤有容易被??别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。; 载体分类 按功能 ①克隆载体（目的基因拷贝 ）； ②表达载体 （基因表达产物 ） 按宿主细胞 ①原核载体；②真核载体；③穿梭载体（携带两种宿主复制子，能在两种生物体内复制。） ;常用的载体有质粒、噬菌体和病毒载体 ①质粒（plasmid）细菌细胞基因组外的共价闭合环状双链DNA分子，能自主复制，能与细菌共生的遗传成分。 ②噬菌体（phage）感染细菌的一类病毒，有的基因组较大，例如λ噬菌和T等；有的则较小，如M13、f1、fd等。 ③动物病毒（virus）质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。;⒈质粒载体;　①比15kb小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制 。 ③质粒对宿主生存并不是必需的 。 ;复制起始点;;质粒载体的优缺点;⒉噬菌体载体;λ噬菌体由头和尾构成，基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。 λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。 ;①溶菌性方式（lytic pathway）：λDNA上基因表达出构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，λDNA复制合成许多子代λDNA，装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂解细菌，释放出许多新的λ噬菌体。 ②溶原性方式（lysogenic pathway）：进入细菌的λDNA可整合入细菌的基因组DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个整合在细菌基因组DNA中的λDNA称为原噬菌体(prophage)，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌.;双链DNA，滚环复制。 溶源性（温和phage ）——感染细菌后，整和到细菌染色体 溶菌性（烈性phage ）——感染后大量复制，细菌死亡破裂。 感染 溶源 条件诱导 溶菌;用作克隆载体的噬菌体 λ噬菌体和M13噬菌体 噬菌体载体的优缺点 ⑴优点——容量大，转染频率高，筛选方便 ⑵缺点——操作困难（需体外包装，CsCl2超速离心），保存困难（滴度下降）;⒊病毒载体;三、工具酶;1.核酸酶 核