aip3b缺失重组体的构建及其与apoptin相互作用的分析 word格式.docxVIP

主要缩写词AIP3BApoptinApoptininteractionprotein3BApoptosisinduceproteinApoptin相关蛋白3B细胞凋亡素bpbasepair(s)核酸碱基对CAVChickenanemiavirus鸡贫血病毒Co-IP DAPICo-Immunoprecipitation4,6-diamidino-2-phenylindole免疫共沉淀4,6-二脒基-2-苯基吲哚DUF59Function-unkowndomain59EDTAEthylenediaineteraaceticacid乙二胺四乙酸EBEthidium bromide溴化乙啶FBSFetal bovineserum胎牛血清FITCFluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素GFPGreen FluorescentProtein绿色荧光蛋白LBLuria-BertaniLB培养基PAGESDSpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰氨凝胶电泳PBSphosphate-bufferedsaline磷酸缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PIrpmPropidiumIodideRevolutionperminute碘化丙啶转/每分钟SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠1AIP3B缺失重组体的构建及其与Apoptin相互作用的研究摘要AIP3B（ApoptinInteractionProtein3B），又名CIA1A、FAM96A(familywithsequencesimilarity96,memberA),该基因定位于染色体上15q22.31，mRNA全长483个碱基，其编码蛋白含有160个氨基酸，大小为18.4kd，链上有锌离子结合位点，在体内以单体和二聚体的形式存在于细胞质中。目前对AIP3B的研究报道较少，有报道表明AIP3B与CIAO1有相互作用，可与CIAO1等形成大分子复合物，构成铁硫簇结合位点。另有学者认为AIP3B在有丝分裂中可能通过稳定姐妹染色体的结合来参与调控姐妹染色体的分离。本课题组前期通过酵母双杂交发现AIP3B与Apoptin在细胞中存在相互作用，并在肿瘤细胞和正常细胞中均证实了这一相互作用。该相互作用能够影响Apoptin细胞核定位及其促凋亡活性。Apoptin是由鸡贫血病毒（chickenanemiavirus, CAV）编码的非结构病毒蛋白，可以特异性诱导人肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，却对正常细胞没有影响，而且它不依赖p53途径产生诱导凋亡作用。Apoptin是一种胞质、胞核穿梭蛋白，其定位决定于细胞给予何种定位信号。在对Apoptin的亚细胞定位检测时发现，它在细胞内的定位与其对肿瘤细胞的杀伤效应密切相关，在肿瘤细胞内定位于细胞核且呈磷酸化状态，磷酸化的Apoptin才有活性，可导致细胞凋亡，而在正常细胞内则定位于细胞质且呈非磷酸化状态，无凋亡活性。因此，深入研究AIP3B和Apoptin之间的相互作用具有重要生物学意义。首先我们采用分子克隆技术，构建带myc标签的AIP3B缺失重组的真核表达质粒，分别为AIP3B△1（缺失的氨基酸序列为1-38）、AIP3B△2（缺失的氨基酸序列为39-119）、AIP3B△3（缺失的氨基酸序列为120-160），分别与pcDNA3.1-flag-Apoptin质粒共转染至HEK293T细胞，提取细胞总蛋白，通过免疫共沉淀检测AIP3B及其各个缺失重组体是否与Apoptin在HEK293T细胞中发生相互作用。通过流式细胞术，检测AIP3B及其缺失重组体对Apoptin对HepG2细胞促凋亡活性的影响。2本实验成功构建了三个AIP3B的缺失重组体。将其各自单独转染或与Apoptin质粒共转染HEK293T细胞中后，均可以成功表达。将AIP3B及其各个缺失重组体质粒分别与Apoptin质粒共转染HEK293T细胞中后提取细胞总蛋白进行免疫共沉淀，结果表明全长的AIP3B、AIP3B△1与Apoptin在HEK293T细胞中均存在相互作用，AIP3B△2和AIP3B△3与Apoptin在HEK293T细胞中不能相互作用。说明AIP3B△2和AIP3B△3缺失的区域可能是AIP3B与Apoptin直接相互作用的关键区域，对应的氨基酸序列范围为39-160，该区域在AIP3B与Apoptin相互作用的时候发挥重要功能，缺失该区域后AIP3B与Apoptin不能直接相互作用。将AIP3B及其各个缺失重组体质粒分别转染HepG2细胞中，并用PTD4-Apoptin融合蛋白处理细胞后，进行流式细胞术检测细胞凋亡，结果表明全长的AIP3B、AIP3B△2及AIP3