渤海溢油区石油降解菌的筛选鉴定及功能基因研究-微生物学专业论文 word格式.docxVIP

渤海溢油区石油降解菌的筛选鉴定及功能基因研究摘要海洋约占地球表面积的四分之三，为人类提供了丰富的资源，对人类社会的 存在和发展具有非常重大的意义。然而，随着人类对海洋资源的不合理开发利用， 使海洋污染日益严重，对人类的危害也愈发明显。在众多的污染源中，石油是一 个不可忽视的元素。2011 年渤海蓬莱 19-3 油田溢油事故，共造成劣四类（劣于 国家海水水质标准中四类海水水质）海水面积 870 平方公里，对渤海生态系统造 成了极大危害。生物修复是治理海洋石油污染的重要方法之一，其中高效石油降解菌在生物 修复中起着举足轻重的作用。细菌中的石油烃降解酶类能够催化降解石油中的烃 类成为小分子物质并以此作为生长所需的碳源和能源。烷烃羟化酶 AlkB、细胞 色素 P450 和黄素结合蛋白 AlmA 是目前研究较为广泛的石油降解酶，能够催化 烷烃降解的起始反应。其中 AlkB 和 P450 主要催化短中碳链的烷烃，但两者降 解底物有一部分不重叠，而 AlmA 主要降解长链烷烃。为获得高效石油降解菌并对其石油烃降解酶基因进行分析，本研究以渤海石 油污染区沉积物为材料筛选石油降解菌群，共分离到 24 株菌，包括 18 株细菌和6 株真菌；结合实验室菌种库中的石油降解相关菌株，对其石油降解率利用紫外分光光度法进行初步测定，从 18 株渤海石油污染区沉积物中分离的细菌中筛选到 11 株高效烷烃降解菌，从实验室菌种库中筛选到 5 株烷烃降解菌，其中菌株 WSL01、WSL14、WH069 和 WH072 的石油降解率在 20%以上。将这 16 株具有 较好石油降解能力的菌株进行 16S rDNA 鉴定，发现渤海石油污染区石油降解菌 主要为 γ-变形菌纲（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）两大类群，且前者 占 90%，说明 γ-变形菌纲的菌株为该区域的石油降解优势种群，其中高城郡海杆 菌（Marinobacter goseongensis）WSL01 和耐盐芽孢杆菌（Bacillus halodurans） WH072 为首次报道的高效石油降解菌，具有极大的研究和应用价值。对高效石 油降解菌的石油烃降解酶基因 alkB、P450 和 almA 进行 PCR 扩增，从菌株 WSL01、 WSL14、WH069 和 WH072 中都扩增到了 alkB、 P450 和 almA 基因，表明 alkB、P450 和 almA 基因与这些菌株的石油降解性能存在着密切关系。根据功能基因编码的氨基酸序列构建系统发育树并分析各个石油烃降解酶基因的进化关系，发现p450 基因在一定程度上具有种属特异性。采用高效热不对称性交错-PCR 方法（hiTail-PCR），对 WSL01 和 WH072 的三种石油烃降解酶基因进行全长序列和 两侧未知序列的扩增，获得了其基因全长和两侧序列；通过对基因编码的氨基酸 进行序列比对并结合系统发育分析发现，WSL01 和 WH072 的 alkB 和 almA 基因 与现有菌株的同源基因相差较大，可能其 alkB 和 almA 基因是相对较新的基因， 其结构和功能有待进一步研究。对 WSL01 p450 基因进行异源重组表达，在重组 菌株中检测到了目的产物。本研究对高效石油降解菌进行了筛选，并研究了其相关基因，为日后对石油 降解菌的基因工程改造和实际应用提供了理论基础。关键词： 石油降解菌；筛选； alkB；p450；almAScreening and Identification of Oil-degrading Marine Bacteria from Spilled Oil in the Bohai Sea and Analysis of Functional GenesAbstractThe ocean occupies three quarters of the earth’s surface and provides plenty of sources which plays a quite important role in the existence and development of human society. However, as the increasingly intensive exploiting of marine sources, the pollution of ocean becomes more and more serious and does more harm to human beings. Among the countless pollution sources, oil becomes so essential that can not be ig