暗河式厌氧产沼技术生物学基础教程.pptVIP

1 现有条件及主要设备 （1）沼气发酵装置：暗河厌氧消化反应器一套 （2）微生物观察仪器：光学显微镜一台 （3）分析仪器：电子天平、紫外-可见分光光度计、离心机、PH计等 （4）微生物培养仪器：超静工作台、高压灭菌锅、 恒温干燥箱、生化培养箱、恒温水浴箱等 2 参与人员 5 需要增添的主要设备、仪器和材料 6 经费概算和来源 7 承担单位和主要协作单位 承担单位：华中科技大学环境科学与工程学院 感谢 谢谢各位 老师！ 同学！ 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功。之后,Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA的原位杂交技术。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位的准确性。1981年,Roumam 首次报道了荧光素标记的cDNA作原位杂交。同年,Langer等用生物素标记核苷酸制备探针。 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用 1986年,Cremer与Licher 等分别证实了荧光原位杂交(FISH)技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。1988年,Giovannoni将原位杂交技术引入了细菌学的研究中,他首先用放射性标记rRNA寡核苷酸探针显微探测细菌。随着安全性较强的荧光技术的发展,1989年,DeLong首先用荧光标记的寡核苷酸探针来探测独立的微生物细胞，此项技术即荧光原位杂交(FISH)技术。随后Amann ,Stahl等人利用该技术对多种环境样品进行了研究,使该技术在环境领域内的应用日趋广泛和成熟。 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用 通过利用FISH技术在环境样品上直接原位杂交,不仅可测定不可培养微生物的形态特征及丰度,而且可原位分析它们的空间及数量分布。德国慕尼黑大学的Amann教授在环境微生物FISH技术研究中,进行了大量深入详尽的工作。Wagner、Manz及Luxmy,在此方面，特别是在污水处理中对微生物的种群原位监测投入了大量的精力，对不同城市污水处理厂混合液样品的微生物种群进行荧光探针原位检测,。 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用 进入20世纪90年代以后,FISH技术在方法上逐步形成了从单色向多色-FISH的发展趋势,灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。 Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素(AFA)标记探针建立了双色FISH技术。1990年，Nederlof 等提出用 3 种荧光素探测 3 种以上的靶位 DNA 序列,创建了多色 FISH 方法。 Perry-O’keefe等[35]应用4种PNA探针的M-FISH对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌进行了检测。 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用 厌氧颗粒污泥是由多种具有互营共生关系的厌氧微生物形成的复杂聚集体,由于其中微生物组成及其相互关系的复杂性、以及某些厌氧细菌(如产氢产乙酸细菌和产甲烷细菌)的生长特异性等,使得对厌氧颗粒污泥的认识至今仍未取得共识。 FISH技术的出现,可以在很大程度上弥补传统方法的不足 。国内外一些学者利用此技术对厌氧颗粒进行了研究。 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用 Harmsen等人利用 EUB338 ,ARC915 ,MX825 和 MG1200 等探针的不同组合,研究发现蔗糖为基质的颗粒污泥分为三层:外层为真细菌,中间层为产氢产乙酸细菌与产甲烷丝菌的共生体,内层存在着较大空洞,有少量产甲烷细菌和无机物;而以混合挥发酸为基质的颗粒污泥只分为较明显的两层:外层是真细菌,内层则以产甲烷丝菌为主。 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用 Sekiguchi等人利用 EUB338 和 ARC915 探针确定了真细菌和古细菌在中温和高温厌氧颗粒污泥中的分布情况,然后利用MX825 ,MG1200 ,MB1174MS1414 和D660 等探针的不同组合对不同种类产甲烷细菌与真细菌的空间分布进行研究。结果表明：中温和高温颗粒污泥具有相似的微生物分布结构,外层主要是真细菌,内层主要是古细菌;颗粒中心均不能被染色,可能是无机物或死亡细菌;古细菌中以索氏产甲烷丝菌为主,在高温颗粒污泥中还存在少量的产甲烷八叠球菌;真细菌则种类较多,主要有脱硫叶菌、互营杆菌、和绿色非硫细菌等。 荧光原为杂交技术（FISH）的发展与应用 Tagawa 等人利用ARC915 ,MB1174 和MT757等探针,采用计