成纤维细胞生长因子10对体外培养的大鼠结膜上皮细胞的生物学作用研究-眼科学专业论文 word格式.docxVIP

第一部分大鼠结膜上皮细胞的原代培养及鉴定近些年，干眼病的发病率逐年升高，并呈现出低龄化的趋势，对人们的日常生 活带来了极大的不便，并影响着人们的身心健康。目前干眼病的药物治疗主要以补 充泪液为主，虽然能够改善症状，但是未能从根本上解决问题；而临床上通过促进 眼表粘蛋白分泌和表达来改善眼表的药物不足，再加之其中一些药物的自身缺点和 局限性，无法广泛应用，为疾病的治疗带来一定的局限性。本研究从此处着眼，希 望能够找到一种促进眼表粘蛋白分泌和表达的药物，为临床治疗提供一个新的方法 和途径。结膜上皮细胞是此次研究的主体，因国内尚无成熟的结膜上皮细胞株，故 研究起始需进行结膜上皮细胞的原代培养，为进一步的实验提供基础。一、材料（一）实验动物材料和方法实验动物选取清洁级成年雄性 SD 大鼠，周龄 6～8 周，体重 250～300g，取自上海市第一人民医院动物房，动物来源于上海市实验动物中心。（二）实验试剂1、 RPMI-1640 培养基（InvitorgenGibco，USA）2、 胰蛋白酶（InvitorgenGibco, USA） 3、 胎牛血清 （InvitorgenGibco, USA）4、 地塞米松（北京双鹤药业股份有限公司）5、 青-链霉素 （InvitorgenGibco, USA）6、 表皮生长因子（EGF）（R D System, USA） 7、 Hanks 平衡盐溶液液（InvitorgenGibco, USA） 8、 75%酒精（上海润成生物科技有限公司）9、 鼠抗人 Pan-keratin 单克隆一抗（Neomarkers, USA） 10、 HRP 标记的山羊抗鼠二抗（Genentech， USA）11、 HRP-DAB 显色试剂盒 （碧云天生物技术有限公司）12、 AB/PAS 免疫组化试剂盒（珠海贝索科技有限公司）13、 BSA 标准品（碧云天生物技术有限公司）14、 苏木素 （武汉博士德生物有限公司）15、 多聚甲醛（上海试剂一厂）16、 乙醇（上海润成生物科技有限公司）17、 Tris 碱 （Sigma, USA）18、 浓盐酸（上海华谊集团上硫化工有限公司）（三）仪器设备1、 恒温 CO2 培养箱 （美国 Nurare 公司）2、 超净工作台 （美国 Nuair 公司）3、 低速离心机 TDL-40B （上海安亭科学仪器厂）4、 精密天平（上海精密科学仪器有限公司）5、 倒置相差显微镜 （Olympus, Japan） 6、 倒置显微照相系统 （Olympus, Japan）7、 恒温水槽 （上海精宏试验设备有限公司） 8、 高速低温离心机（Eppendorf，Germany） 9、 微量加样器（Eppendorf, Germany）10、 蒸汽高压灭菌锅（SANYO autoclave MLS-3780）11、 显微手术器械 （张家港奥斯卡医疗器械有限公司）12、 培养皿（Corning， USA）13、 烧杯（上海精密科学仪器有限公司）14、 离心管（上海精密科学仪器有限公司）15、 吸管（上海精密科学仪器有限公司）16、 细胞计数板 （上海精密科学仪器有限公司）17、 手术刀片 （上海科技进出口有限公司）18、 盖玻片（上海精密科学仪器有限公司）19、 载玻片（上海精密科学仪器有限公司）20、 Eppendof 管（Axygen, USA）21、 眼科显微镜（上海精密科学仪器有限公司）（四）试剂配制及用法1、 10×TBSTris 碱 24.2g，NaCl 80g,加 Milli-Q 水至 800 mL，用盐酸调 pH 至 7.6，加 Milli-Q水定容至 1L 备用。临用前稀释至 1×。 2、 1×PBSNaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.42g, KH2PO40.27g, 加 Milli-Q 水至 800 mL，用 盐酸调 pH 至 7.4，加 Milli-Q 水定容至 1L,置于 4℃冰箱备用。3、 消化液D-Hanks 液 100mL，胰蛋白酶 0.25g，EDTA0.06g，混合搅拌至完全溶解，一 次性抽滤分装，-20oC 冰箱保存备用。4、 结膜组织清洗液100mL 生理盐水，加入青链霉素 1mL，混合均匀，一次性抽滤分装，4oC 冰 箱保存备用。5、 4%多聚甲醛称取 4g 多聚甲醛，加入 80 mL PBS 置 60℃水浴至完全溶解，冷却至室温， HCl 调 PH 至 7.0，加 PBS 定容至 100 mL 备用。二、方法（一）结膜上皮组织取材及培养1、 本研究采用组织块培养法进行结膜上皮细胞的原代培养；2、 将 SD 大鼠 CO2 麻醉 1 分钟，然后颈椎横断法处死，75%酒精消毒眼睑周围毛 发 2 分钟；3、 将大鼠固定于手术台面，并用小剪刀剪除眼眶