目标产品的蛋白质分析检测.ppt

目标产品的蛋白质分析检测技术与质量控制;主要内容;一、蛋白质含量和纯度;考马斯兰G-250法：此试剂在酸性条件下与蛋白反应，当吸收峰由465nm转移到595nm，灵敏度高，测定蛋白的浓度范围广。 遗传工程产品蛋白质的纯度要求：95%、99%、99.9%。 常用鉴定蛋白纯度的方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS、毛细管电泳（CE）、等电聚焦（IEF）、HPLC（包括凝胶过滤、各种反相HPLC、离子色谱、疏水色谱）;五种蛋白质测定方法比较;新的方法：如质谱法，仅pmol的样品就能测定，同时能给出分子量。 注意：只用一种鉴定蛋白纯度的方法是不够，往往几种 （方法，机理）结合使用。 ;二、氨基酸分析;两类方法： 柱后反应法： 将游离的氨基酸经色谱柱分离后，氨基酸再与显色剂（茚三酮[吸光度检测]、荧光胺、邻苯二甲醛[荧光检测]）作用，然后导入检测器。 优点： 反应可自动化，定量定性、重现性优异。 由于反应前试样成分在柱中分离，“杂质”被去除，比较稳定。;柱前衍生法： 将各种氨基酸和荧光试剂先作用生成衍生物，再分离，直接检测衍生物的荧光。 特点： 反应系统小，试剂用量少。 可使用高价格的试剂，低背景，可提高灵敏度。 即使检测出未反应试剂，但经柱分离，也不会影响检测。;氨基酸水解方法： 通常是5.7mol/L HCl真空状况下110℃水解24h，也有在150 ℃下快速水解4h。 不同条件下，各种氨基酸的回收有所不同，且有的氨基酸会遭受破坏（如色氨酸）。 保证氨基酸分析准确性的方法： 过去用胰岛素为标准样品来判断， 近年来采用“测试肽法”，即将20种常见氨基酸人工合成一个20肽。然后水解，每种氨基酸残基出现频率是1，易于校正回收。;新的方法： 毛细管电泳，仅需ng的量，分辨率和准确性均比SDS好。 质谱，灵敏度和准确性都很好，精确度达0.01%。;;三、蛋白质分子量的测定;毛细管等电聚焦电泳-电喷雾质谱技术（CIEF-MS）：分辨率极高，能分辨的等电点差异小于0.04pH。 一些标准样品用此法分析可发现亚型（分子量完全一样，等电点不同）的存在。 如细胞色素C两个亚型分别为9.60、9.55。一般的方法根本无法分辨。;四、蛋白质的等电点;五、肽谱;化学裂解： 最常用的是溴化氰，作用于Met C端和其次一个AA的肽键。如γ-干扰素有4个Met，可被裂解成5肽段。 BNPS-3甲基吲哚、N-氯代琥珀酰亚胺作用于Trp-X键上； 2-硝基-5硫氰基苯甲酸作用在X-Cys键上； 羟胺作用在Asn-Gly键上。;;六、蛋白质突变点的分析;酶解后，用液质分析，寻找与理论值分子量不一致的肽段。;新的方法：CE-MS联机来检测IL-2突变点，更快速和准确。;七、蛋白质的二硫键分析