第6章节 蛋白质的分离、纯化和表征.pptVIP

Protein; 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大;蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 ;蛋白质电泳： 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带 正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于 等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电 场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳— 带电粒子在电场中移动的现象。;蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象 利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离纯化。 根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一种方法是电泳法。;电泳; 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27千克 ;（一）根据化学组成测定最小分子量;;;;;;（三）凝胶过滤法测定相对分子质量;蛋白质混合样;三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀;蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因： １、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。 如：－NH3＋、－COO－ 、－OH、-SH、-CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。 ;2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。 蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。 ;蛋白质胶体性质的应用;;二.蛋白质的沉淀;蛋白质沉淀定义： 蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。;（一）可逆沉淀;1.?盐析 在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。 而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。 盐析的机理： 破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。;2.弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀） 用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。 弱酸或弱碱沉淀法机理： 破坏蛋白质表面净电荷。;酸;3.?有机溶剂沉淀法： 在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理： 破坏蛋白质的水化膜。 注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。;（二）不可逆沉淀;4.重金属盐沉淀(条件：pH 稍大于pI为宜) 当pH 稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。 重金属沉淀法的机理： 重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救。 ;5.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI） 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。（小檗碱、麻黄碱 、吗啡） 能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物碱试剂沉淀蛋白质的机理： 在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 例如：“柿石症”; 吃柿子小心胃结石！ 年龄偏大的人，消化功能减退，多食易得柿石病。空腹也不要多吃柿子。 如果连皮一起吃更容易形成胃结石，皮中含的鞣酸更多。 含高蛋白的蟹、鱼、 虾在鞣酸的作用下， 很易凝固成块，形 成胃结石。 ;6.加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速. 如：煮鸡蛋 卤水点豆腐 （少量MgCl2加入到大豆 蛋白质的浓热溶液中）;四、蛋白质分离纯化的一般原则;五、蛋白质的分离纯化方法;血液透析;2、密度梯度（区带）离心;;3、凝胶过滤;（二）利用溶解度差别的纯化方法;（三)根据电荷不同的分离方法—电泳;等电聚焦电泳;双向电泳;;离子交换层析;（四）利用蛋白质选择性吸附的性质;（五）利用对配体