第八章 植物基因的克隆原理与相关技术.ppt

;内 容;基因克隆所需要的酶和载体;一般认为 基因工程诞生于1973年 上世纪40年代——70年代初 分子生物学领域 理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。;;;;;;;;提取;基因克隆所需要的酶类;1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的命名和分类 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应;限制性内切核酸酶的发现 50年代发现了大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制系统； 60年代后期证明了细菌的限制和修饰系统； 1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶； 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶Hind II，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。;限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。;限制性核酸内切酶的概念;限制性核酸内切酶的命名;2、修饰性酶用M表示，限制性酶用R表示 如 R. Hin M. Eco 3、用一个正体字母表示菌株的类型 如Escherichia coli RY13 Eco R 4、以罗马数字表示分离出来的先后顺序 如Eco R I、 Hin d III;限制性内切核酸酶类型： 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶;不同类型核酸内切酶主要特性的比较分析;II型限制性核酸内切酶的3大特点;与II型核酸内切酶有关的几个概念;平 末 端 (Blunt end)：因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。 ;同裂酶 (isoschizomers )：能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。;同尾酶(isocaudamers):识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。 注 意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。; 经同尾酶消化的DNA末端连接示意图;影响酶活性的因素很多： DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素 纯度的鉴定：紫外吸光值A260/A280 浓度低于500ng/? L 酶切消化的缓冲液 Mg2+ Tris-HCL BSA（牛血清蛋白） 酶切反应的???度（通常为37℃） 影响酶切消化的其他因素 时间 体积 RNA;酶切反应的基本步骤;1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略;DNA连接酶的发现;DNA连接酶作用的特点;DNA连接反应的条件;平末端DNA片段的末端加尾连接法;平末端DNA片段加接头连接法;;大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow fragment T7 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 Taq聚合酶 逆转录酶;DNA聚合酶;逆转录酶 一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA (complementary DNA)。实际上，是一种RNA依赖的DNA聚合酶。 来源 RNA肿瘤病毒。 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）和鼠白血病毒反转录酶（avian myeloblastosis virus, M-MLV） AMV的性质 由?和?两条多肽链组成。;聚合酶活性和 RNaseH活性。 RNaseH： 经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以5’?3’或3’?5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。;逆转录酶的用途 合成cDNA 以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。;DNA修饰酶 末端脱氧核苷酸转移酶 T4多核苷酸激酶 碱性磷酸酶;碱性磷酸酶的特性： 催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。;;A-OH;基因工程载体;基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。;;载体分类 根据功能分： 克隆载体:克隆一个基因或DNA片断 表达载体:用于一个基因的蛋白表达 整合载体:把一个基因插入到染色体组中 根据来源： 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 人工染色体载体;质粒载体;质粒载体 （plasimid vectors）;1.质粒载体的生物学特性;质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。 质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋3种。;质粒DNA的分子构型;