关于研究分析蛋白质细胞定位的几种方法二.pptxVIP

关键词：蛋白质细胞定位细胞定位免疫荧光 免疫胶体金标记 GFP 真核细胞具有复杂的亚细胞 结构，已发现数十种细胞器，每种细胞器都有一 组特定的蛋白。真核细胞除叶绿体，线粒体能少 量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或粗糙内 质网合成，最终运送到不同地点，形成成熟蛋白 并行使功能。译产物中很大一部分是以前体蛋白 形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋 白在胞内定位。蛋白质在细胞内的定位问题，是 细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研;究的热门话题。了解某些蛋白质的定位从而分析 探索其生物学功能，意义重大。目前，这方面的 己取得很大进展。细胞器不同，相应的靶向蛋白 的定位过程也不同。研究蛋白的亚细胞定位可采 取多种方法：免疫胶体金标记；免疫荧光；与 gfp 构建融合基因，用荧光显微镜观察;蔗糖密度梯 度离心;多糖序列分析等。以下介绍免疫胶体金 标记、免疫荧光、与 gfp 构建融合基因等常用方 法。1 免疫胶体金标记金标法是 Faulk 和 Taylor 提出的，并首先用于免疫电镜。当用金标记的抗;不起那天都讲了什么，也不记得自己做了什么，但是，自始至终木子都没有和袁;的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。 电镜水平的免疫金染色是目前较理想的免疫定 位方法，具有特异性强、灵敏度高、定位准确和 具有双重标记功能等优点。例如用连有 15nm 金 颗粒的 GFP 单克隆抗体以及连有 lOnm 金颗粒的 过氧物酶体的标志酶抗体作为一抗进行免役金 标 ， 证 明 CAT1-GFP 定 位 在 过 氧 物 酶 体 (AkaneKamigakieta1.,2003)。 2 免疫荧光根据抗 原与抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标 记上荧光素制成荧光标记物荧光标记物，再用这;不起那天都讲了什么，也不记得自己做了什么，但是，自始至终木子都没有和袁;用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗 原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞化学 技术。 S.pagny 等(2003)将 XYIT36:GFP 转入拟南 芥，检测发现荧光出现在高尔基体。使用植物 Lewis(高尔基体标志分子)抗体以及 BIP(内质网 标志分子)抗体进行免疫荧光标???，发现 GFP 的 绿色荧光与使用 Lewis 抗体所做的免疫荧光存在 共定位，而与 BIP 分布在不同部位。说明 XYIT36:GFP 定位在高尔基体。3GFP 及其在生命 科学研究中的应用 3.1 简介 GFP 海洋生物发光是;不起那天都讲了什么，也不记得自己做了什么，但是，自始至终木子都没有和袁;编码，具有 238 个氨基酸残基的多肽单体，分子 量约 27kD。GFP 有两个吸收峰，最大吸收峰在 395nm，在 475nm 还有一个吸收峰，前者由紫外 光激发，后者由蓝光激发。发射光谱也有两个峰 值:509nm 和 540nm,呈绿色或黄绿色荧光。 GFP 荧 光的产生主要归功于分子内第 65,66,67 位丝氨 酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。翻译出 的蛋白折叠环化后，在 O2 存在下分子内第 67 位 甘氨酸的酰基对第 65 位丝氨酸的羧基的亲核攻 击形成第 5 位碳原子咪唑基，第 66 位酪氨酸的。;window._bd_share_config={mon:{bdSnsKey :{},bdText:,bdMini:2,bdMiniList :false,bdPic:,bdStyle:0,bdSize :32},share:{},image:{viewList:[c opy,sqq,qzone,tsina,tqq,renren;不起那天都讲了什么，也不记得自己做了什么，但是，自始至终木子都没有和袁