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三、常用的载体 （一） 质粒 (plasmid)： 是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点： 1. 分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内， 有较高的拷贝数 2. 具有1个以上的遗传标志，便于筛选 3. 具有多克隆位点 总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。 广泛应用的质粒： pBR322质粒、pUC系列等 pBR322质粒 ① 4363 bp ② 含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素标 记(ampR) ④ 一个抗四环素标记 (tetR) ⑤ ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入 当外原基因插入抗药基因位点时，AmpR→Amp敏感(AmpS )、TetR→Tet敏感(TetS). pUC系列质粒 由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体； （1） 2674bp； （2） 有ampr和与M13噬菌体 相同的多克隆位点（MCS） （3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断, 编码半乳糖苷酶 (二)λ噬菌体 组成特点： 双链线状DNA分子， 全长50kb， 含65个基因， 在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。 λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长（lytic pathway） 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长(lysogenic pathway) 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。 λ噬菌体两种生长途径（示意图） 第三节 重组DNA基本原理 （DNA重组基本程序包括下列过程） 分—获取目的基因和载体 切—限制酶切割目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选与鉴定 1、获取 DNA重组基本过程 2、重组 3、转化 4、筛选 5、克隆 6、表达 表达产物分离纯化 一、目的基因的获取（分） 目的基因 是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。 目的基因来源 1） 制备基因组DNA 2） 制备cDNA 3） 聚合酶链反应 4） 人工合成基因 （一）制备基因组DNA（基因文库） 分离、纯化基因组DNA 条件：温和，在EDTA或SDS等存在下 ↓RE 用蛋白酶K消化细胞、酚抽提 大小不同酶切片段 片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离 ↓ 分别与同样RE消化的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 ↓ DNA连接酶连接。 导入细胞 进入宿主细胞内培养扩增。 ↓ 筛选鉴定 用分子杂交、凝胶电泳 等方法鉴定。 （二）制备cDNA （cDNA文库） （1）合成cDNA第一条链 反应体系只有mRNA、逆转录酶、4种dNTP、引物。 引物是与mRNA3ˊ端 polyA互补的寡聚dT（12～18dT片段） （2）合成cDNA第二条链 RNase去掉模板mRNA （3）构建cDNA文库 ①　cDNA两端加接头或衔接头 接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。 衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。 ②　cDNA与载体相连。 ③　导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cDNA集合体便是cDNA文库。 （二）制备cDNA （cDNA文库） 分离目的基因 的mRNA 逆转录生成cDNA单链 水解去除mRNA， 合成cDNA双链 水解回