重组人胰岛素生产工艺监控方法研究进展孔毅.doc

—————————————————————————————————————— 重组人胰岛素生产工艺监控方法研究进展_孔毅 药　物　生　物　技　术 PharmaceuticalBiotechnology　2003,10(2):121～124121 重组人胰岛素生产工艺监控方法研究进展 孔　毅,乔德水 1 2 Ξ (1.南京大学生命科学学院,南京210093;2.江苏万邦生化医药股份有限公司,徐州221002) 摘　要　重组人胰岛素生产工艺复杂,。文章介绍了PAGE、HPLC、HPCE及MS在生产各阶段监控中的应用关键词　重组人胰岛素;工艺监控;聚丙烯酰胺凝胶电泳;质谱中图分类号:Q857　　文献标识码:A　　)0121-　　,血糖升高,。,我国糖尿病病人已超过3000万。胰岛素是治疗糖尿病的一线药品,它是由A和B两条多肽链组成的蛋白质激素。A链含21个氨基酸残基,B链由30个氨基酸残基组成,共有3个二硫键,其中2个连接A链和B链,1个在A链内[1]。过去人们使用从猪、牛等动物胰脏中提取出来的胰岛素来治疗糖尿病,这些胰岛素与人体胰岛素存在有氨基酸的差别,对人体来讲是异体蛋白,长期使用会引起不同程度的免疫反应[2],提取人体胰岛素缺乏可行性。基因工程的出现使人胰岛素生产成为可能,1982年EliLilly公司首先采用基因工程的方法生产出人胰岛素[3],这是基因工程药物的开端。 人胰岛素市场前景广阔、经济效益巨大、市场竞争激烈,改革工艺、降低成本、提高市场竞争力是各大公司科研投入的热点。重组人胰岛素生产工艺复杂、技术含量高、难度大,对生产各阶段的准确监控是生产工艺改革的前提。因此,围绕生产过程的各种检测方法在不断改进,生产效率不断提高。本文就生产过程中分析方法的研究做一概述,为生产工艺的改革奠定基础。 基因重组人胰岛素的主要生产步骤如下[4]:工程菌发酵、提取包含体、包含体中分离融合蛋白、还原融合蛋白中的二硫键、融合蛋白复性、纯化融合蛋白、胰蛋白酶水解融合蛋白、纯化含胰岛素的肽段、羧肽酶B水解含胰岛素的肽段、纯化人胰岛素。 对工艺的监控主要包括:包含体中胰岛素原的含量、胰岛素原的折叠情况、胰蛋白酶及羧肽酶B对胰岛素原的酶切效率及胰岛素的纯度。 主要监控手段有:聚丙烯酰胺凝胶电泳法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法及质谱法。 。并且SDS可以估计蛋白质的分子质量。然而,在胰岛素的分析过程中普通SDS法很难得到理想的结果,因为常规电泳分离蛋白质的分子质量下限是12000u,而胰岛素的分子质量为5800u,A链约 2300u,B链约3400u,即使是胰岛素原的分子质量也只有10000u左右,Fling等对常规方法的改进使得分离下限可达2500u。但是当用Fling所研究的方法时,B链在电泳中不正 常的偏高,A链不能被染色,原因可能是不正常的迁移使得 A链的电泳条带不存在或是在染色前A链没能被固定Schagger等 [5] [2] 。 发展了TricineSDS,在电泳中Tricine作 为尾随离子使得这种电泳可分辨1～100000u分子质量的蛋白质。Cowley等[6]利用TricineSDS对重组胰岛素原在MonoQHR5Π5中各组分进行分析,得到了理想的结果。石继红等[7]利用Tricine电泳分析小分子多肽,在每孔上样 μ量为5～10g时,可以检测分子质量为2512u的多肽。 普通聚丙烯酰胺凝胶电泳(不加SDS)分离蛋白质的机理是基于电荷差别与分子质量差别的共同结果,胰岛素原的复性过程中,正确折叠与错误折叠胰岛素原存在电荷与结构的差别,因此可用此方法来监控胰岛素原的复性过程。 在胰岛素原表达时多采用融合蛋白表达法,不同的融合蛋白具有不同的等电点,等电聚焦电泳可以测得变性与复性好的融合蛋白的等电点,从而指导融合蛋白的分离纯化。 2　高效液相色谱法(HPLC) HPLC是快速、准确、分辨率高的分析方法。其主要分 离模式有反相色谱法、分子排阻色谱法及离子交换色谱法, 3种不同分离机理的方法可以相互补充从而达到对不同样 品的高效分离,在胰岛素分析中应用广泛[8,9]。 2.1　反相液相色谱法(RP-HPLC) 反相液相色谱固定相多为硅胶键合相,由于在碱性条件下硅胶上的有机物易脱落,因此此类色谱柱的使用pH范围为2.0～8.0,高于此pH会对固定相造成不可逆的破坏, 1　聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE) 该法是蛋白质分析中最常用的方法之一,具有设备简 Ξ收稿日期:20