新生大鼠心肌细胞的培养和分离.pptVIP

新生大鼠心肌细胞的培养和分离? 张建1孙丽1 代宇峰1 单媛媛1 徐磊1邵焱奔1 陈永昌2 1 江苏大学医学院01-11-1 2 江苏大学医学院生理教研室 摘要 目的：建立心肌细胞培养模型，用于心肌细胞体外实验。 方法：采用胰酶消化及新生大鼠心肌细胞与非心肌细胞如成纤维细胞、血细胞等的差时贴壁法分离提纯心肌细胞，建立心肌培养模型。 结果：心肌细胞培养最长成活时间达3天，心肌细胞受消化时间的影响有不同的形态表现。 结论：可以利用差时贴壁法分离新生鼠心肌细胞并在体外进行培养，胰酶消化以低浓度短时间为佳。 1. 材料和方法 1.1心肌细胞的消化 取一只加盖烧杯，内放一块用乙醚饱和的纱布，把0~3日龄的大鼠幼鼠放进该烧杯中麻醉，用2%碘酒和75%酒精消毒胸腹皮肤，在无菌条件下开胸取出心脏，立即置于4oC D-Hanks液(mmol/L：Nacl 137, Kcl 5.4, Na2HPO4 0.37, K2HPO4 0.44, NaHCO3 4.2)中剪取心室肌，洗净残血，剪成约1mm3大小的组织块，弃去D-Hanks液加入0.08% 胰蛋白酶液10~15ml，于37°C静置5min，吸出上层悬液，并加入等量的含血清培养基。经终止消化后离心(1800r/min)弃上清液，加入含血清的培养液。吹散沉淀细胞，同条件下离心，用10%血清培养液制成细胞悬液，置于37°C含5%CO2培养箱中。 1.2心肌细胞分离 根据心肌细胞和非心肌细胞贴壁时间的不同采用2小时差速贴壁，分别获得心肌成纤维细胞和心肌细胞。心肌细胞按1*106个细胞/ml种于50ml培养液中，培养的前2天在心肌细胞培养液中加入5-溴脱氧嘧啶核苷0.1mmol/l，以抑制非心肌细胞增殖，所有培养的心肌细胞均每2天换液一次。 1.3心肌细胞的无血清培养 当心肌细胞培养24小时后换无血清培养液（含DMEM培养液，胰岛素10?g/ml, 铁蛋白10?g/ml，维生素C100?g/L维生素B121.5μmol/L）继续培养48小时,每隔8小时换液一次,尽量保持各添加成分浓度不变,最后收集细胞,进行测定。 2.实验结果 本次实验中新生大鼠心肌细胞培养最长存活时间为3天。实验采取低浓度，短时间胰蛋白酶消化的方法。消化时间不同，所得到的细胞有不同的形态变化:消化3~5分钟，高倍镜下观察心肌细胞大部分呈新月形，并可见细胞在培养液中呈头尾相连的过程，呈动态变化。而消化5~10分钟的心肌细胞卷曲呈圆形,密度低,活动能力差。细胞培养约8小时后向一处聚集，彼此钩连呈现高密度区，这可能与细胞之间形成连接有关。由于某种不明原因，多次培养过程中心肌细胞中都出现不明微生物，致使细胞在3天后基本死亡。 3.实验讨论 有很多文献报道新生大鼠心肌细胞的培养时间为10~12天,本次实验的培养时间为3天,与之比较成活时间较短,但本实验可以说明低浓度胰蛋白酶消化液(0.08%)比一般浓度(0.125%)的消化时间效果好,消化时间在3~5分钟内可减少细胞死亡率.实验过程中出现的细胞向一处聚集的现象和可见的连续的形态变化,可以说明体外培养心肌细胞重新连接成更大单位细胞团是可能的,它们可能通过形态的变化相互钩连,连接成网. * *