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谷氨酸液体发酵 摘要 目的 学习实验室发酵罐谷氨酸液体发酵。方法 用分光光度计测定发酵过程中发酵液的还原糖和谷氨酸的浓度。结果 没能得到谷氨酸发酵的理想曲线。结论 本实验结果并不理想，但我们已经对快速检测发酵进程有了基本了解。 关键词 谷氨酸液体发酵；谷氨酸棒杆菌；质量控制 1.材料与方法 1.1谷氨酸菌种制备及扩大培养 1.1.1一级种子培养培养目的在于制备大量高活性的菌体，培养基配方如下：葡萄糖 2.5％；尿素 0.5％；硫酸镁 0.04％；磷酸氢二钾 0.1％；玉米浆3%；硫酸亚铁 2ppm；硫酸锰 2ppm。00mL三角瓶中装00mL培养基，0.1MPa灭菌30分钟，冷却后接种，接种量为一支斜面接一瓶。30～32摇床培养12小时 1.1.2二级种子培养培养目的制备和发酵罐体积及培养条件相称的高活性菌体。，冷却后接种，摇床培养7～8小时。培养基配方：葡萄糖 2.5％；尿素 0.34％；磷酸氢二钾 0.16％； 糖蜜 1.16％；硫酸镁 0.043％；消泡剂；pH 7.0 1.1.3接种 接种一级种子，用接种环从斜面菌种刮取少量菌种到接种瓶中。之后用移液器移取菌种到二级种子培养瓶中。 1.1.4并种 将每3瓶二级菌种无菌合并在1000mL的三角瓶里，放入冰箱待用。 1. 2发酵培养基制备 按工艺要求配制发酵培养基，10升发酵罐定容6升，实际配料时，定容到预定体积的60％左右（即10升发酵罐定容4升），另40％体积为蒸汽冷凝水和种子液预留。培养基配方：葡萄糖 13％；硫酸镁 0.06％；磷酸氢二钾 0.1%；糖蜜0.3％；硫酸锰、FeSO4 各2ppm；氢氧化钾 0.04％；玉米粉 0.125％；消泡剂 0.5%。调整pH为7.0。尿素配成40％浓度，装在1000mL瓶中，每一瓶装800mL。分消备用。消泡剂配成1%浓度，分消备用。 1.3发酵培养装置消毒及培养过程控制 空气过滤器及空气管路的消毒 发酵罐空消 电极校正 发酵罐实消 接种发酵过程的温度控制pH控制 1.5还原糖测定 1.5.1葡萄糖标准曲线制作 取5支15mm×150mm试管，按设计梯度加入0.4mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 1.5.2样品中还原糖的测定 取7支15mm×150mm试管，分别按设计加入试剂：在发酵罐中小心取样，然后4000rpm离心5分钟除去菌体细胞。加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。 1.8谷氨酸测定 1.8.1谷氨酸标准曲线制作 取试管，分别加入配制好的谷氨酸纯品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml，补水至3ml。随后每只试管中加入0.5mL茚三酮试剂，塞上PVC胶塞。摇匀管内溶液，迅速置于80 ℃水浴锅中加热15min，不停地摇动。快速取出保温到时的试管，将之插入冰浴锅中，静置5min，不停地摇动。以蒸馏水为空白对照，测出各浓度标准样品OD569值。 1.8.2谷氨酸发酵液预处理 取谷氨酸发酵液于11400 r/ min离心5 min，取上清液弃去菌体，用蒸馏水稀释100倍，调节pH 5. 5～6后备用。 1.8.3发酵样品谷氨酸含量检测 取3 mL预处理好的发酵液加入18mm×180mm玻璃试管中，调整发酵液pH5.5左右。沿试管壁加入0.5mL茚三酮试剂，塞上PVC胶塞。将试管中液体振匀，迅速置于80℃水浴中加热15min。快速取出保温到时的试管，放入冰浴锅中，静置5min。将分光光度计波长调至569nm处，以100倍稀释的空白液体发酵培养基为空白对照，测出OD569值。 2． 2.1还原糖测定 2.1.1葡萄糖标准曲线制作 表1 葡萄糖标准液的吸光值 管号 葡萄糖标准液/ml 蒸馏水/ml 葡萄糖含量/mg OD540 葡萄糖标准液/ml 蒸馏水/ml 葡萄糖含量/mg OD540 0 0.0 1.0 0.00 0.000 3 0.6 0.4 0.24 1.245 1 0.2 0.8 0.08 0.197 4 0.8 0.2 0.32 1.536 2 0.4 0.6 0.16 0.726 5 1.0 0.0 0.40 1.971 图1 葡萄糖标准曲线 由于实验时间不够，