凋亡相关蛋白pote在晚期非小细胞肺癌顺铂耐药中的功能研究-呼吸内科专业论文.pdf.docxVIP

A549细胞和A549/DDP细胞中的表达差异。收集应用含铂双药治疗的临床样本（肿瘤组织），初步分析POTE表达变化与NSCLC患者化疗疗效之间的关系。本研究共分三部分进行：第一部分:A549/DDP 耐药株建立及生物学行为鉴定【目的】A549细胞株基础上诱导的A549/DDP细胞株的建立及其生物学行为的鉴定。【方法】采用顺铂敏感人肺腺癌细胞株A549经顺铂诱导产生对顺铂耐药的耐药细胞株A549/DDP；MTT法检测两细胞株对顺铂的敏感性。【结果】1. 人肺腺癌敏感细胞株A549顺铂诱导产生耐药的细胞株A549/DDP。2.MMT法检测结果显示顺铂对A549和A549/DDP细胞的增殖均有抑制作用，顺铂对A549和A549/DDP细胞的IC50值分别为5.6和42.6ug/ml，耐药倍数为7.57倍。【结论】成功获得了人非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP，明确耐药细胞株的耐药指数为7.57倍。第二部分POTE蛋白在A549细胞中主要的表达亚型及其在铂类耐药中的作用和机制【目的】本部分实验旨在筛选出A549细胞中POTE主要表达的亚型，明确其在A549和A549/DDP细胞中分子水平和蛋白水平的表达差异，探讨POTE-2γ与凋亡相关因子（Fas、Bax、Bak、Caspase-3）的关系。【材料和方法】1.运用Trizol提取A549细胞中的总RNA；2.运用PCR产物克隆筛选的方法，筛选出62个菌落测序；3.运用DNAstar软件进行碱基比对；4. 应用蛋白印迹法(Western Blot, WB)验证POTE-2γ在A549和A549/DDP细胞中的表达差异；5.运用蛋白印迹的方法分别检测顺铂在不同时间和浓度梯度时，A549 及A549/DDP两细胞株中POTE-2γ及凋亡相关因子（Fas、Bax、Bak、Caspase-3）表达量的变化；6.构建慢病毒载体,感染A549细胞，下调POTE-2γ表达，蛋白印迹检测目标蛋白（Fas、Bax、Bak）表达变化。【结果】1.PCR克隆筛选出的62个菌落中，其中4个测序失败，58个完成测序。完成测序的58个序列通过碱基比对均为POTE-2γ。2.慢病毒对A549细胞中POTE-2γ表达量的干扰效率约73.6%。.蛋白印迹法及免疫细胞化学验证结果显示POTE-2γ在A549及A549/DDP两细胞株间存在表达差异。.蛋白印迹结果显示顺铂在不同时间和浓度梯度POTE-2γ在A549及A549/DDP 两细胞株间存在表达差异。5.在A549细胞中下调POTE-2γ的表达，凋亡相关蛋白（Fas、Bax、Bak）表达的表达量也相应下调。【结论】1.在A549细胞中主要表达的POTE亚型是POTE-2γ。2.POTE-2γ在A549细胞中的表达量明显高于A549/DDP细胞。3.POTE-2γ可能通过上调Fas等促凋亡因子，下调Bax，Bak等抗凋亡受体发挥促凋亡作用，而与顺铂耐药相关。第三部分NSCLC患者组织中POTE-2γ表达水平与含铂双药化疗疗效的相关性【目的】探讨POTE-2γ表达与晚期NSCLC患者一线使用含铂双药方案治疗的疗效的关系。【材料和方法】.收集接受一线含铂双药治疗的晚期NSCLC患者的肿瘤组织；.采用Trizol法提取组织中的总RNA；.采用Fermentas RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit逆转录；4.采用实时荧光定量PCR 检测组织中POTE-2γ的表达量；5.运用SPSS软件分析数据。【结果】1. POTE-2γ高表达的患者一线使用含铂双药方案的疗效优于低表达者，且与患者的性别相关（P=0.003）；POTE-2γ高表达的患者TTP（TimeToProgress）和OS（OverServival）均长于POTE-2γ低表达的患者。【结论】POTE-2γ可能可以作为晚期NSCLC患者一线使用含铂双药方案化疗疗效的预测因子，但需要大样本前瞻性的研究加以验证。【关键词】晚期非小细胞肺癌；顺铂耐药；POTE-2γ；凋亡相关蛋白；肿瘤标记物作者：陈秀指导教师：周彩存教授ABSTRACTBackground：Lung cancerisoneofthemost common malignanttumors in the world. Its morbidityhashadthetendencytoriseobviouslyandthemorbidityisrising yearbyyearinChina.Non-smallcell lungcancer(NSCLC)is themain pathologicaltypesoflungcancer,accountingfor80%.Approximately 65%-70%lung