蛋白质组研究技术及其应用.pptVIP

蛋白质组学技术 样品制备 双向凝胶电泳 蛋白质差别点分析 胶内酶解 质谱分析 数据库检索 蛋白质组研究与蛋白质研究方法对比 研究策略 整体 vs. 个体 落实到蛋白质组中的单个蛋白质成分的研究技术，并没有脱离蛋白质研究的基本框架。 蛋白质组学大规模技术的发展必然促进了对单个蛋白质的研究。 很多在单个蛋白质研究中得以应用的技术也很快应用到蛋白质组学研究中。 蛋白质组学技术—样品全息制备 蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步。 针对不同来源的样品(如细胞,动物组织,植物,体液等)，需要采取不同的蛋白质抽提方法。 样品制备或样品的预处理已经成为蛋白质组学研究的一个瓶颈,对研究者提出了更高的要求。 在适合的盐浓度下,可重复溶解所有的蛋白质 避免溶解度低的蛋白质在等电聚焦时沉淀析出 防止蛋白质化学修饰,包括蛋白质降解,蛋白酶或尿素热分解后引起的修饰 排除核酸,脂类和其他干扰分子 获得的目标蛋白质应在可探测水平，有时需要去除高丰度蛋白质和不相关蛋白质 样品制备的步骤: 细胞破碎 蛋白沉淀 蛋白溶解 抑制蛋白酶活力 去除 --- 核酸，脂类 --- 盐类，缓冲液，离子，小分子 --- 不溶物 双向凝胶电泳常规样品制备实例 常规细胞培养，待长至80%左右密度时，在处理前一天更换新鲜培养液 吸去培养液，用预冷PBS清洗细胞，重复3次 1×106细胞加50μL，往培养皿中加裂解液(8mol/L Urea，4%CHAPS，40mmol/L Tris，65mmol/L DTT)，刮刀收集 进行超声波处理，处理时间为5s，间歇时间为10s，功率在100-120W之间，超声处理至溶液清澈无粘稠物为止 4℃ 25 000g 离心1小时 取上清测蛋白质浓度后，分装后-70℃冰箱中冻存 不同来源样品处理方案 双向凝胶电泳 双向凝胶电泳是蛋白质组学中对蛋白质进行研究的主要分离方法，是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。 基本原理 根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。 电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色，然后用相关软件对电泳图象进行分析。 常规染色样品要求 常规的Trypsin酶解 样品要求 防止角蛋白污染:途径皮屑、毛发、口水等。 样品状态：考马斯亮兰染色,快速银染法,Ruby荧光 染等胶内蛋白质 上样量大于400ug（最关键的是目标蛋白的量，分子量小的蛋白，要求质量要大一些） 如：18kD的蛋白要比60KD蛋白的量大 银染过程中不要使用氧化剂，不使用戊二醛 使用的碳酸胺溶液一定要新鲜配置。 所切取的蛋白斑点要尽量小，蛋白密度高 Thermo Finnigan proteome X LC-MS/MS (ESI) 串联质谱（BuildSummary软件）结果分析 MALDI-TOF与ESI-MS/MS进行蛋白质鉴定的比较 ESI-MS/MS 由于MS/MS具有结构分析功能，可以获得检测到的每一肽段的序列。根据一级质谱(MS)测得的精确分子质量和串联质谱(MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。 优点： 通过串联质谱大大增加了蛋白质鉴定的准确性。 对图谱的精确度和分辨率要求不如PMF高。 采用纳升喷雾提高检测的灵敏度。 缺点： 通量与速度不如MALDI。 数据库检索比较费时。 蛋白质鉴定结果常见问题 由于角蛋白等蛋白质的污染，造成鉴定为污染蛋白。 由于蛋白量过少引起鉴定结果的评分低，可信度不高。 由于蛋白质纯度不足，造成鉴定结果为混合蛋白质。 由于蛋白质为未知蛋白，造成鉴定无结果。 质谱鉴定蛋白质的进一步验证 Western-blot 免疫组化 放射免疫酶标法(ELISA） 生物质谱技术 基本原理： 将样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比(m/z)的差异来分析蛋白质和多肽的分子量和对蛋白质进行鉴定,定量及其修饰点分析。一台质谱仪一般有进样装置，离子化源，质量分析器，离子检测器和数据分析系统组成。 生物质谱分类 生物质谱技术的应用 蛋白质/多肽肽质谱图 蛋白质/多肽分子量测定（MS） 溶液及胶内蛋白质/多肽的质谱鉴定 蛋白质突变点鉴定 蛋白质磷酸化分析 蛋白质糖基化分析 复杂蛋白质混合物鉴定（Shotgun-MS） 蛋白质ICAT差异定量 蛋白质修饰位点分析 基质辅助激光解析-飞行时间质谱（MALDI-TOF) 基本原理： 将样品均匀包埋在固体基质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子进入气相，并将一部分能量传递给样品分子使其离子化，然后通过不同离子的飞行时