栉孔扇贝(chlamys farreri)组织凝集活性分析及一种c-型凝集素单克隆抗体的研制和特性研究-海洋生物学专业论文.docx

栉孔扇贝（Chlamys farreri）组织凝集活性分析及一种 C-型凝集素单克隆抗体的研制和特性研究 摘要凝集素是贝类生物体液免疫的主要执行者之一，是抵御外来病原体侵袭和环境刺激的重要“屏障”，在病原识别以及止血、凝固、物质运输和创伤修复等生理 过程中都具有重要作用。C-型凝集素（C-type lectin）作为宿主防御系统中的一 种模式识别蛋白（Pattern recognition protein，PRP），在病原体识别和细胞间的相 互作用上具有重要作用。本论文比较了栉孔扇贝血淋巴以及其它不同组织粗提液 对高等动物血细胞和多种菌体的凝集活性；并从栉孔扇贝血淋巴中分离纯化了甘 露聚糖结合凝集素（Mannan-binding lectin，MBL）；制备了C-型凝集素CfLec290 的单克隆抗体，并结合RT-PCR技术、原位杂交技术对其在栉孔扇贝（Chlamys farreri）血细胞以及 其它不同组织中的分布特性进行分析，为研究栉孔扇贝凝集 素在免疫防御机制中作用积累了数据。本论文主要包括以下4个部分：（1）栉孔扇贝血淋巴以及其它不同组织粗提液的凝集活性分析。本论文通 过超声波破碎或组织匀浆的方式分别制备了栉孔扇贝血细胞以及其它组织，包括 鳃、外套膜、肝胰腺、性腺、肾脏以及肌肉组织的蛋白粗提液，并将其与血淋巴 上清的蛋白浓度都调整为1 mg/mL，然后分别测定这8组样品对2种动物红细胞血 液和9种菌悬液的凝集活性，并测定EDTA、多种糖溶液对其凝集活性的影响。结 果发现：血淋巴上清不仅可以凝集小鼠红细胞，还可以凝集鳗弧菌、金黄色葡萄 球菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母，其凝集活性可以被EDTA、葡聚糖、甘露糖-6-磷酸、N-乙酰葡萄糖胺，甘露聚糖、酵母聚糖、硫酸软骨素、肽聚糖和脂多 糖不同程度的抑制；鳃组织粗提液可以凝集金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和毕 赤酵母，且凝集活性可以被EDTA、N-乙酰半乳糖胺、甘露聚糖、酵母聚糖、硫 酸软骨素、肽聚糖和脂多糖不同程度的抑制；外套膜、肝胰腺、性腺和肾脏提取 液均只能凝集枯草芽孢杆菌，且该凝集反应主要受到甘露聚糖、酵母聚糖以及肽 聚糖的抑制；此外，栉孔扇贝血细胞及肌肉组织粗提液并未发现凝集活性。这些 结果表明，在栉孔扇贝体内有多种类型凝集素的存在，且在血淋巴上清中的类型 和数量最为丰富，而这正与扇贝强大的体液免疫系统息息相关。（2）栉孔扇贝血淋巴甘露聚糖结合凝集素的分离纯化。本论文依次通过硫酸铵盐析和甘露聚糖-亲和层析柱亲和层析，从栉孔扇贝血淋巴上清中分离纯化 出甘露聚糖结合凝集素，通过对其凝集活性的检测以及蛋白分子量的分析发现： 提纯的MBL可以凝集鳗弧菌和毕赤酵母，对高等动物血细胞以及其它检测菌体 并无凝集活性；MBL在Native中的分子量为645 kDa，在SDS中的分 子量为73 kDa，表明该凝集素是由一种亚基组成的多聚体。（3）抗栉孔扇贝C-型凝集素Cflec290单克隆抗体的制备和筛选。本论文首 先通过体外重组表达获得重组蛋白rCfLec290，免疫小鼠后，经细胞融合技术制 备了抗rCfLec290单克隆抗体，并分别通过ELISA技术和Western blotting 技术对 抗体进行筛选，最后筛选出3株可稳定表达单抗的细胞株1A2、1A7和2B6。（4）C-型凝集素Cflec290在栉孔扇贝血细胞及其它不同组织中的分布。首 先通过半定量RT-PCR技术检测Cflec290 mRNA 在血细胞以及其它不同组织中的 表达含量，再通过制备地高辛标记的Cflec290的cRNA核酸探针，检测血细胞滴 片以及其它不同组织切片中mRNA表达的位置，最后通过抗重组蛋白rCfLec290 单克隆抗体检测该凝集素在血细胞滴片及不同组织切片中的分布情况。结果发 现：通过半定量RT-PCR，Cflec290在血细胞以及其它各组织中均有表达，但在外 套膜、肾脏以及性腺中的转录水平最高，血细胞、鳃和肝胰腺次之，在肌肉中的 转录水平较弱；原位杂交显示，阳性信号主要发现在栉孔扇贝的外套膜表皮细胞 以及肝胰腺管壁细胞中，在其它组织中并未发现；通过利用抗重组蛋白rCfLec290 的单克隆抗体的间接免疫荧光检测发现，CfLec290蛋白主要分布在扇贝血细胞 膜，以及鳃、外套膜、肝胰腺等组织表皮和腔体表面。结果表明，Cflec290可在 栉孔扇贝血细胞、外套膜表皮细胞和肝胰腺管壁细胞中合成与表达，功能蛋白则 广泛分布于扇贝血细胞及各组织器官中，在血细胞膜，鳃、外套膜、肝胰腺表皮， 腔体表面尤为丰富。依此推测，血细胞、外套膜和肝胰腺在Cflec290合成和表达 过程中发挥着重要作用，该凝集素在血细胞、外套膜或肝胰腺细胞内合成后，被 分泌到细胞外，伴随着体液流动，被运输到全身多组织器官中行使功能。关键词：