调控rock通路对氧糖剥夺后少突胶质前体细胞增殖和分化影响-神经内科专业论文.docx

第一部分大鼠脑少突胶质前体细胞的体外培养与鉴定中文摘要目的：探索SD大鼠脑少突胶质前体细胞（oligodendrocyteprecursorcells，OPCs）的分离与体外培养方法，观察其体外生长、标志物表达及定向分化能力。方法：取出生后3天内SD大鼠全脑，采用0.125%的胰蛋白酶消化后培养10天左右，获得原代混合胶质细胞，在恒温摇床180rpm振摇过夜并差速贴壁40分钟获得纯化的OPCs。采用少突胶质前体细胞标志物A2B5和NG2抗体对纯化后培养3天的细胞进行免疫荧光染色鉴定OPCs细胞纯度，并取OPCs诱导分化3天后进行少突胶质细胞标志蛋白MBP及O4的免疫荧光染色。结果：采用胰蛋白酶消化法获取原代混合胶质细胞、振摇并差速贴壁法分离纯化能够得到纯度较高的OPCs，呈双极或三极形态，折光性强，免疫荧光染色显示95%细胞表达A2B5和NG2，经诱导分化后可表达MBP及O4。结论：采用振摇并差速贴壁法自SD大鼠全脑可分离纯化获得纯度较高的少突胶质前体细胞，体外生长稳定，经诱导可分化为成熟的少突胶质细胞。关键词：少突胶质前体细胞；细胞培养；免疫荧光PartOneMethodofIsolationandIdentificationofOligodendrocytePrecursor CellsAbstractObjective:Toexploretheimprovementmethodofisolationandidentificationofoligodendrocyteprecursorcellsfromneonatalratbraininvitro.Methods:Themixedglialcells fromSDratsbrainwereobtainedusingthe0.125%trypsindigestion. About10dayslater,OPCswereisolatedandpurifiedbytheshakingprocessanddifferentialadhesion,andculturedinOPCs medium.ThegrowthpatternofOPCsinvitro wasobserved byinvertedmicroscope，andimmunofluorescenceassaywasappliedtoidentifytheOPCswithNG2,A2B5andtheoligodendrocyteswithO4andMBP.Results:PuredOPCswereobtainedinthis methodbytheshakingprocessanddifferentialadhesion.EnrichedOPCsarephasebrightwithtypicalbipolarortripolarmorphology. Morethan95%ofthecellswereNG2andA2B5positive.Meanwhile,theOPCscanbe induceddifferentiationtooligodendrocytes,whichwereO4andMBPpositive.Conclusion:OPCscanbeseparatedandpurifiedbyshakinganddifferentialadhesionfromSDratsbrain.Meanwhile, OPCscanbeinduceddifferentiationtooligodendrocytesinvitro.Keywords:Oligodendrocyteprecursorcells;Cellculture;immunofluorescence前言少突胶质前体细胞(oligodendrocyteprogenitorcells，OPCs)是上世纪80年代初发现的神经胶质细胞[1]，在成年CNS中占据所有胶质细胞数目的5%-8%左右。它在鼠类胚胎期E14.5d出现，出生后分布均匀，并在成熟CNS中持续存在[2]。OPCs是处于分化早期的未成熟细胞，既能定向分化为成熟的少突胶质细胞（Oligodendrocytes，OLs），又具有一定的增殖与迁移能力，其分化为成熟的OLs需经过一系列特定阶段，包括增殖状态的OPCs（表达NG2和A2B5标志物，具有双极或三极形态），未成熟OLs（表达O4标志物，具有多极形态），最后是成熟的OLs（表达MBP 标志物）[3]。当中枢神经系统发生脱髓鞘，成熟的OLs 自身不能修复，其再生依赖于OPCs的增殖分化[4]。研究发现体外移植OPCs 入脑后，OPCs 迅速迁移并增加成熟OLs数量，同时形成髓鞘包绕轴突[5]。探索一种简单的OPCs分离纯化方法不但可以更好的体外研究OPC