第一章-常规技术.pptVIP

1.7 Genetic transformation of microorganisms, plants and animals 肺炎链球菌的转化 细菌转化最早是由F．Griffith于1928年在研究肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)时发现的。 1944年O．T．Avery等人证实引起这种细菌转化的因子是DNA。 细菌转化本质是DNA分子 转化现象的普遍性 现在已经知道，除了肺炎链球菌以外还有许多种细菌，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽泡杆菌(Bacillus stearothermophilus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)等，都能够发生转化作用。 大肠杆菌的转化 长期以来一直认为大肠杆菌缺乏天然的转化机理。 夏威夷大学的M．Mandel和A．Higa(1970)首先报道。在生长的大肠杆菌在0℃下加入到低渗的氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀(形成原生质球)，同加入在转化混合物中的A噬菌体DNA形成一种粘着在细胞表面上的对DNase抗性的复合物。转移到42℃下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会被细胞所吸收。 1972年，S．N．Cohen等人证明，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞，还是质粒DNA的良好的转化受体。 细菌转化的基本过程是： 　　将正在生长的大肠杆菌在0℃下加入到低渗透压的氯化钙溶液中，造成细胞膨胀，进入感受态的生理状态，同加入在转化混合物中的重组DNA形成一种粘着在细胞表面上的能够抵抗核酸酶的复合物，转移到42℃下作短暂的热刺激（细菌从0℃突然转到42℃，因温度变化很大，对细菌细胞的刺激效果很好，同时又不杀死细胞），这种复合物便被细胞吸收。在富裕培养基上生长一段时间使转化基因实现表达之后，再涂布在选择性的培养基上分离转化子。转化子就是捕获了外源DNA的细菌菌株。这种基本的转化程序稍加修改之后，可用来转化各种不同的细菌体系。 细菌转化频率 影响细菌转化频率的因素 DNA的浓度、纯度和构型，转化细胞的生理状态及其在CaCl：处理和贮藏之后的成活率，及转化的条件 诸如温度、pH值、离子浓度等。 　　应用与大肠杆菌转化程序相类似的方法，目前，酿酒酵母、哺乳动物的组织培养细胞、高等植物细胞或原生质体也能被外源DNA转化。 Introduction of DNA into animal cells Example 1 :A eukaryotic gene of interest is cloned in a plasmid containing a drug resistance marker that can be selected for in cultured animal cells. The plasmid DNA is introduced into cultured cells as a calcium phosphate coprecipitate（磷酸钙沉淀物）, which is taken up and expressed by a fraction of the cells for a few days (transient expression). Stably transformed cells, in which the plasmid DNA becomes integrated into chromosomal DNA, can be selected for by their ability to grow in drug－containing medium. Example 2 : Cloned genes can also be introduced into the germ line of multicellular organisms, allowing them to be studied in the context of the intact animal rather than in cultured cells. 植物遗传转化 　　目前已经建立起来的将外源基因导入植物细胞内的方法很多。有根癌农杆菌参与的植物转化法，也有DNA直接导入法。 农杆菌介导的植物转化法 目的基因通过这种方法进入植物细胞要分几个步骤走。 　　第一，将目的基因重组到适当的Ti质粒载体或Ri质粒载体或其它类型的载体上。根据所选用的载体系统进行重组。重组方法就是基因工程中常用的一些基本方法。 　　第二，目的基因随载体进入农杆菌（即转化农杆菌）。这一步与