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DNA测序技术的原理、方法和判读 一、原理 1、DNA的结构 人类基因组是指人体DNA分子所携带的全部遗传信息。（以基因这一概念为主导，探询基因间的关系） 人的单倍体基因组由24条双链的DNA分子组成（包括1～22号染色体DNA与X、Y染色体DNA），上边有30亿个碱基对，估计有3～5万个基因。最新文献为25000个。 人类基因组计划就是分析测定人类基因组的核苷酸序列。 其主要内容包括绘制人类基因组的四张图，即遗传图、物理图、序列图和转录图。 绘制这四张图好比是建立一个“人体地图”，沿着地图中一个个路标，如“遗传标记”、“物理标记”等，可以一步步地找到每一个基因，搞清楚每一个基因的核苷酸序列。 核酸的基本组成单位是核苷酸。 核苷酸可以进一步水解为核苷(nucleoside)和磷酸。 核苷又可以水解为戊糖(pentose)和碱基(base)。 如下： 核酸 → 核苷酸 → 核苷﹢磷酸 ↓ 戊糖﹢碱基 核苷酸中的戊糖包括： 核糖 和 脱氧核糖 (ribose) (deoxyribose) ↓ ↓ 存在于： 核糖核苷酸 脱氧核糖核苷酸 （RNA） （DNA） 脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的结构式如下： 组成DNA的核苷酸是脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)。 核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，分属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。 核苷酸中 嘌呤碱基主要有鸟嘌呤(guanine)和腺嘌呤(adenine)； 嘧啶碱基主要有：胞嘧啶(cytosine) 、胸腺嘧啶(thymine)和尿嘧啶(uracil) 。 其中尿嘧啶只存在于RNA中，而胸腺嘧啶只存在于DNA中。 碱基与戊糖以糖苷键相连接构成核苷 通常：戊糖的C1’与嘧啶碱的N1或嘌呤碱的N9相连接。 核苷中的戊糖与磷酸以磷酸酯键连接构成核苷酸。 上世纪50年代初，Chargaff应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对多种生物DNA作碱基定量分析，发现DNA碱基组成有如下规律： （1）同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同； （2）一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营 养状态或者环境变化而改变 ； （3）几乎所有的DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤 摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相同([A]=［T］)， 鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同 ([G]= ［C］)，总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相 同(［A＋G］=［C］＋［T］) ； （4）不同生物来源的DNA碱基组成不同，表现在 A＋T/G＋C比值的不同 。 这些结果后来为DNA的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证。 1953年，Watson和Crick以立体化学原理为准则，对Wilkins和Franklin的 DNA? X射线衍射分析结果加以研究，提出了DNA结构的双螺旋模式 DNA双螺旋模型主要内容： 在DNA分子中，两股DNA链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺旋结构，双螺旋的螺距为3.4nm，直径为2.0nm。 链的骨架(backbone)由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成，位于双螺旋的外侧。 碱基位于双螺旋的内侧 两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、近于平面的环形结构彼此密切相近 平面与双螺旋的长轴相垂直。 一股链中的嘌呤碱基与另一股链中位于同一平面的嘧啶碱基之间以氢链相连，称为碱基互补或碱基配对(base?pairing) 碱基互补配对总是出现于腺嘌呤与胸腺嘧啶之间(A=T)，形成两个氢键；或者出现于鸟嘌呤与胞嘧啶之间(G=C)，形成三个氢键。 DNA双螺旋中的两股链走向是反向平行的，一股链是5’→3’走向，另一股链是3’→5’走向。 两股链之间在空间上形成一条大沟(major groove)和一条小沟(minor?groove)，这是蛋白质识别DNA的碱基序列，与其发生相互作用的基础。 双螺旋结构模型，揭示了遗传信息是如何储存在DNA分子中，以及遗传性状何以在世代间得以保持。这是生物学发展的重大里程碑。 DNA双螺旋的稳定由互补碱基对之间的氢键和碱基对层间的堆积力(base stacking?force)维