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PCR技术及其延伸 — 理论与经验 杨 元 四川大学 华西医院 医学遗传室 内容提要 基因组DNA（基因）的基本结构与化学组成 聚合酶链反应（PCR）的基本原理及步骤 聚合酶链反应（PCR）体系的组成及作用 PCR实验可能遇到的问题与解决办法 PCR实验室污染的应对措施 PCR引物设计的原则与种类 荧光定量PCR技术的基本原理 荧光定量PCR技术的应用与可能的困难 基因组DNA的基本结构与化学组成 DNA Timeline 1866-Gregor Mendel published the results of his investigations of the inheritance of factors in pea plants. PCR技术的发明者 PCR技术出现的背景 1955年发现?DNA?polymerase?I； 70年代的初期Dr.?H.?Klenow发现具有实验价值及可得性的Klenow?fragment?of?E.?Coli； 1976年从热泉?Hot?spring的细菌(Thermus?Aquaticus)?中分离出能耐高温 Taq?polymerase； 1971年Dr.?Kjell?Kleppe?提出类似基因修复复制?(DNA-? repair?replication)的PCR原始雏形概念； 1983年Dr.?Kary?B.?Mullis发展出PCR技术，并于1985年与?Saiki?等人正式发表了第一篇相关的论文。 1989?年，Science?将PCR中的DNA合成酶命名为 Molecule ? of?the?year，而PCR本身则列为年度的重要科学发明产物。 PCR技术的基本原理与步骤 PCR 反应参数 预变性：94℃下预变性5-10min，使模板DNA 完全解链。减少非特异性配对的引物与模板复合物形成。 循环中的变性：一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。扩增片段GC含量的差异是变性温度选定的主要依据， GC含量高则应相应提高变性温度，反之亦然，但一般不应低于90℃。应注意变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。 循环中的复性（退火）：PCR 的一个关键参数，在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。如何解决这个矛盾？合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm[4X（C+G）+2X（A+T）或软件计算] 低5℃,当产物中出现影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。退火温度越高,所得产物的特异性越高。 当多重PCR扩增各引物对Tm值出现差异时，如何初步确定退火温度？一是将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃；二是根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。 当退火温度较高以致接近延伸温度时，如何设定PCR参数？将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。 退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度，因此…… 循环中的延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。 循环次数 ：循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。 如经25-30 轮循环扩增后,产物量仍不够 怎么办？一是增加模板量重新扩增；二是将扩增的DNA 样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达109-1010。 扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。其中：C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使