实时荧光定量PCR技术检测牙周炎致病菌中16S rRNA DNA探针制备.docVIP

实时荧光定量PCR技术检测牙周炎致病菌中16S rRNA DNA探针制备 　　【摘要】 利用实时荧光定量PCR和细菌16S rRNA测定技术制备牙龈卟啉菌染色体探针，并进行检测，为进一步研究牙周病可疑致病菌提供方法。主要方法是：厌氧环境下培养牙龈卟啉菌，抽提细菌DNA；根据基因库已知牙龈卟啉菌16S rRNA DNA序列，设计特异性的TaqMan探针和一对引物；经实时荧光定量PCR仪进行细菌DNA样本的PCR反应获得反应曲线。结果表明，细菌DNA样本经PCR反应后，在15个循环时，开始出现扩增曲线，此后荧光逐渐增强，在26个循环后达峰值。由此可见，利用细菌16S rRNA技术制备致病菌染色体探针，经实时荧光定量PCR测定，可以对目标微生物进行准确定性和定量。 　　【关键词】 实时荧光定量PCR 牙龈卟啉菌 探针 　　 　　与牙周病有关的微生物主要是牙菌斑（dental plaque），特别是龈下菌斑（subgingival plaque）中的革兰阴性专性厌氧菌和噬二氧化碳菌，如牙龈卟啉菌(porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)[1,2]。P. gingivalis是目前公认的牙周可疑致病菌，也是牙周微生物领域重点研究的厌氧菌之一[3,4]。研究认为，P. gingivalis附着于宿主组织细胞的表面是引起牙周病的先决条件[5]。准确地检测P. gingivalis对牙周病的预防、治疗和活动性监测均大有裨益。随着分子生物学和分子遗传学的持续发展，利用DNA识别微生物和测定微生物数量的技术因其特异性强、敏感性高、检测方便快捷等特点得以迅速发展。其中，16 S rRNA技术已经以其独特的优越性，开始应用于口腔微生物菌群的检测，并作为细菌分类和鉴定的“金标准”而应用于口腔细菌的研究中[6-8]。本研究的目的是采用16 S rRNA技术制备P. gingivalis染色体探针，为进一步研究P. gingivalis提供方法。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1菌株及细菌DNA抽提 　　1.1.1菌株 　　将P. gingivalis ATCC33277菌株（由首都医科大学口腔医学院口腔微生物实验室提供）接种于5％绵羊血厌氧基础琼脂平板上，置厌氧产气袋（法国 Biomerieux Co., Inc.）中于37℃培养箱中培养7天后收获菌落。将P. gingivalis菌落用无菌TE液配成细菌悬浊液，约106CFU ml-1备用。 　　1.1.2 细菌DNA的抽提 　　主要操作步骤如下：200μl 细菌悬浊液加400μl Cell Lysis Solution混匀，再加入6μl Proteinase K混匀，置于55℃水浴10分钟；加入600μl 氯仿小心混匀；10，000转/分室温离心2分钟后取500μl 上清于Eppendorf管中，加500μl Precipitation Solution混匀，室温2分钟后10，000转/分离心2分钟；去上清后加100μl 1.2mol/L NaCl，轻轻振荡至沉淀溶解，加300μl 冰冻乙醇，－20℃10分钟后10，000转/分离心5分钟，吸走乙醇，70％乙醇洗涤一次，倒置室温干燥10分钟；100μl TE溶解DNA待用。以上试剂皆由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。 　　1.2 引物和探针 　　根据NCBI ( / )的GenBank 上提供的16S rRNA DNA序列， 以及Hiroshi等[9]介绍的方法（见图1）进行P. gingivalis ATCC33277菌株16 S rRNA 基因组引物和 TaqManTM 探针设计（见表1）。引物和探针交由大连TaKaRa公司合成。 　　 　　 　　1.3 实时荧光定量PCR反应 　　将细菌DNA、引物（ 终浓度约500nM ）、TaqManTM 探针（终浓度约200nM ）和Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa公司提供）按规定组份（见表2）在冰上配制PCR反应液于96孔板上。细菌DNA的扩增和检测在ABI Prism7000定量 PCR 仪（美国Applied Biosystems Co.）上进行，采用两步法PCR扩增标准程序，循环参数为95℃ 预变性10 s后，95℃ 变性5 s，60℃ 退火31 s，40个循环。 　　 　　2 结果 　　 　　根据Real-time PCR扩增曲线原理，Baseline阶段为荧光背景信号阶段，在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。在荧光信号指数扩增阶段，即探针检测到样品DNA扩增的时候，会有荧光曲线出现，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系