蛋白含量测定细则.docVIP

样品批号： BRADFORD（Commassi Blue G-250） (BSA 0.5 mg/ml) 管 号 BSA含量（μg/ml） BSA体积 （μl） ddH2O （μl） 考马斯G-250 （ml） OD595 0 0 0 100 2.5 0 1 50 10 90 2.5 0.098 2 100 20 80 2.5 0.195 3 150 30 70 2.5 0.293 4 200 40 60 2.5 0.395 5 250 50 50 2.5 0.499 6 300 60 40 2.5 0.590 7 350 70 30 2.5 0.689 1、BSA配制过程 1）牛血清白蛋白（Albumin bovine serum，BSA）：批号911110；规格1g；生化纯；德国柏林格尔曼海姆进口分装，中国医药公司北京采购供应站经销，4℃保存。 2）标准蛋白溶液BSA配制（g/ml） 精确称取mg牛血清蛋白（BSA）用ddH2O精确定容至0ml。mg牛血清蛋白（BSA）ddH2O溶解，转移至10ml容量瓶中，用ddH2O清洗烧杯中残留的牛血清蛋白（BSA）0ml，混匀后分装至小瓶或EP管中，每份1 ml，写好标签，于-20℃冻存。 3）BSA标准液（500μg/ml） 取1ml BSA母液（g/ml）ddH2O，混溶，即稀释5倍，得BSA标准液（500μg/ml），于4℃备用。 2、考马斯亮蓝G-250配制 储备液：精确称取0mg考马斯亮蓝G-250，加入100ml 95%乙醇和200ml 88%磷酸，充分搅拌混匀。精确称取0mg考马斯亮蓝G-250， ml无水乙醇，加ddH2O 5ml至100ml，再量取200ml 88%磷酸，ml大烧杯中，玻璃棒搅拌均匀后倒入500ml的棕色瓶中，盖盖，室温下可长期保存备用。 工作液：取30ml储备液，加入15ml 95%乙醇和30ml 88%磷酸，用ddH2O精确定容至500ml。待充分混匀后用Whatman 1号滤纸过滤，置于00ml的棕色瓶保存。 准备支BSA和ddH2O（注意直接用洗耳球吹到试管底部），再加入CBBG，充分混合。8号管（空白管）调零点，按常规操作过程进行比色，用721分光光度计测量，于595nm处光吸收值。以蛋白浓度对595nm处的光吸收值作图，得到蛋白质浓度标准曲线。将目的蛋白溶液稀释适当倍数，使测定值位于标准曲线中部的线性区间内。ddH2O；依次倍比稀释为10×，100×，200×。第一管加入50μl目的蛋白原液；混匀后，往第二管加入50μl；混匀后，往第三管加入200μl，混匀，共得400μl稀释200倍的目的蛋白溶液。 2）分析过程 用微量进样器取稀释后样品液100微升，其它操作过程同标准曲线。 测定记录（595nm处吸收值在0.1-0.3）稀释200倍样品： 试管编号 595nm处吸收值 平均值 mg/mL 1 0.213 0.215 21.6 2 0.217 3 0.216 4（空白） 0 5（空白） 0 测定记录（595nm处吸收值在0.3-0.5）稀释100倍样品： 试管编号 500nm处吸收值 平均值 mg/mL 1 0.429 0.4297 21.5 2 0.433 3 0.427 4（空白） 0 5（空白） 0 3）其它说明： 比色皿：1cm直径玻璃比色皿；仪器：721分光光度计，上海 4）用Excel做工作曲线，相关系数≧98%（附曲线） 样品蛋白含量：21.6 mg/mL 操作人（签字）————————— 复查人（签字）————————— 2011年 月 日