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脆弱类杆菌生产琥珀酸：过程优化与发酵罐中扩大培养 李斌(工程硕士) 引言 琥珀酸是三羧酸循环的中间体，产于植物、动物和微生物有机体。然而，厌氧微生物将琥珀酸作为它们能量代谢的主要终产物来生产，并且具有储藏琥珀酸的潜力。类似于Actinobacillius succinogenes, Bacteroides amylophilus, Ruminococcus flavefaciens这些菌种的细菌生产琥珀酸以为人们所知。有趣的是，Rotstein等报道了一些Bacteroides sp.的菌株生产大量琥珀酸作为毒性因子。按照他们的研究，脆弱类杆菌生产含有丰富琥珀酸的聚糖胶团，这些琥珀酸从胶团中释放并阻碍白细胞的移动，而白细胞可以在一定位点治疗脓肿。 琥珀酸是一个关键的化合物，它可以衍生出30多种有重要经济意义的产品，例如1,4-丁二酮，四氢呋喃，己二酸，γ-丁内酯等。它很好的应用于食品，医药，树脂，聚合物，印染，化妆品，墨水等等。它也被用作表面活性剂，清洁剂的添加剂，仿沫剂，离子螯合剂以及一些重要的化工产品。迄今为止，琥珀酸主要通过化工方法生产，然而，基于环境和可持续发展方面考虑，研究开始转向微生物发酵生产琥珀酸。发酵生产琥珀酸较之化工方法生产琥珀酸具有很多优势，这是因为前者更简单并且环境友好。虽然发酵生产琥珀酸的微生物早已被开发出来，但真正经济上可行的合成琥珀酸的方法仍然在发掘中。 在这方面，为了开发最大生产这个重要的生物分子的方法，方法设计，培养基标准化，发酵条件，菌种改良是非常重要的。方法优化可作为这个生物分子最有效合成的范例。 培养基的初始糖浓度，复合氮源，接种量，碳酸根离子浓度，PH，温度等生理和营养因子被发现是影响细胞生长和琥珀酸生产的最关键影响因素。在当前的研究中，过程优化用来加强脆弱类杆菌产琥珀酸。接着，在10L发酵罐上进行这个重要生物分子合成的扩大研究。 材料和方法 化学药品 琥珀酸从sigma公司购买。HPLC超纯水作为流动相。所有其它用作培养基的化学药品都 是分析纯，皆从当地购买。 菌株和培养条件 我们先前已经报道了一种对于牛瘤胃微生物的扩大筛选方法来选出琥珀酸生产菌株。结 果筛选出B16菌株作为生产琥珀酸的有效菌株。这个菌株属于转型厌氧菌，它是革兰氏阴性，多形杆状，囊状结构并在自然界中可分解糖。微生物培养于装有300ml培养基的500ml厌氧瓶中，其中培养基成分为：葡萄糖20.0，蛋白胨10.0，酵母抽提物5.0，K2HPO43.0，NaCl1.0,(NH4)2SO41.0，CaCl2·6H2O0.2，NaCO31.0，PH6.5。 培养基在瓶中以橡胶塞封口，以氮气封顶，在121℃下灭菌15分钟。氮气可被二氧化碳代替，加入Na2S·9H2O(0.02%)以除去溶氧。种子培养基接种量2%，培养24h之后于39℃±1℃下转种。 琥珀酸样品的制备和生长分析 在所需的培养阶段，培养物在Remi（R-24）离心机中以5000×g离心10分钟。上清用来 分析琥珀酸产量，菌体沉淀用来做生长评价。在这里，沉淀要用2ml二蒸水洗涤并重新离心5分钟，这个过程重复三次以便除去细胞表面的培养基物质。然后，沉淀重悬于1ml二蒸水，并在660nm波长下以二蒸水为空白读取吸光度值。 分析琥珀酸的方法 琥珀酸的产量用高效液相色谱来判断。然后，培养液在Sorvall离心机上以8000×g离心 10分钟，过滤，每个测试样品取20μl在HPLC上测试。 分批发酵的过程优化 在培养基上优化琥珀酸生产，其中不同的生理和营养参数被研究。在琥珀酸生产中温度 的研究范围为20-50℃，类似的，PH的影响是通过加入一系列的缓冲液来分析的[0.2M柠檬酸磷酸缓冲液(PH4.0，5.0，6.0)，0.2M磷酸钠缓冲液(PH6.5-7.0)，0.2M tris-HCl(PH8.0)]。 为了优化营养参数，首要考虑的营养参数是碳源，它影响细胞生长和产物形成。因此设计了一系列的实验，其中葡萄糖用不同的单糖(葡萄糖和果糖)，二糖(蔗糖和乳糖),多糖(鼠李糖和阿拉伯糖)，糖醇(甘油和甘露醇)来替代，它们在培养基中的浓度为0.5%w/v。选择好的糖还要优化出能使琥珀酸产量最高的最优糖浓度。同时细胞生长也要被检测。然后优化氮源，蛋白胨(1.0%w/v)用不同的无机氮源代替(磷酸氢氨，氯化铵，硝酸钠和尿素)，以及用不同的有机氮源代替(酵母抽提物，牛肉抽提物，蛋白胨，玉米浆，胰蛋白胨，麦芽抽提物)，他们的添加比例是相同的。更进一步，可以优化出所选择的氮源的浓度。除碳源和氮源，为了判断金属离子的影响，不同金属离子(Na+,Mg2+,Ca2+,Zn2+,K+,Mn2+)的碳酸盐/硫酸盐/氯化物以1%的浓度分别加入培养基。为了进一步找到是最适金属盐的基本部分还是酸根部分影响琥珀酸的