dnmt1和ezh2介导microrna200ba429基因甲基化沉默促进肿瘤发生发展word格式论文.docxVIP

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密√。（请在相对应的方框内打“√” ）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要目的明确DNMT1和EZH2在miR-200b/a/429启动子区域相互作用协同调控启动子甲基化机制的存在，研究其调控miR-200b/a/429表达下调机制，并探讨表观遗传学药物5-氮杂胞苷（5-Azacytidine）和DZNep 对于肿瘤生长的影响。方法第一部分是选取胃腺癌细胞（MGC-803 和BGC-823 细胞）和胶质瘤细胞（U87细胞）作为研究对象，应用5-氮杂胞苷（5-Azacytidine）或DZNep分别作用于上述细胞系，提取各细胞株总RNA应用RT-PCR技术检测miR-200b/a/429 在处理前后的表达情况；将EZH2 siRNA 或DNMT1 siRNA应用细胞转染技术导入细胞，提取各细胞株总RNA采用RT-PCR技术检测miR-200b/a/429在处理前后的表达情况，提取经上述四种处理（5-氮杂胞苷、DZNep、EZH2siRNA和DNMT1siRNA）的各细胞株总蛋白采用免疫印迹(Western Blot)技术检测相关蛋白在蛋白水平的表达情况。第二部分应用co-IP 技术检测EZH2和DNMT1在体内相互作用情况，CHIP分析DNMT1与miR-200b/a/429启动子区域相互作用。第三部分是5-氮杂胞苷或DZNep作用于裸鼠动物模型分析其对肿瘤生长的影响，并运用免疫组化检测两种药物对相关蛋白表达的影响。结果1.组蛋白甲基转移酶抑制剂DZNep 和EZH2siRNA 抑制组蛋白甲基化相关蛋白，如EZH2、EED、SUZ12，DNMT1及H3K27me3的表达并重新激活miR-200b/a/429 的表达。2.DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-Azacytidine）和DNMT1siRNA抑制EZH2、SUZ12、DNMT1和EED的表达并上调miR-200b/a/429的表达。3.Co-Ip证实DNMT1与EZH2在体内天然结合，两者共同在体内甲基化调控中发挥作用。4.CHIP分析证实DNMT1结合于miR-200b/a/429 的启动子区域。5.在体内实验中，DZNep 和5-氮杂胞苷（5-Azacytidine）抑制肿瘤生长，免疫组化结果显示DZNep和5-氮杂胞苷抑制EZH2、SUZ12等的表达。结论miR-200b/a/429的表达调控中表观遗传学修饰发挥了重要作用。miR-200b/a/429 的表达水平与其基因启动子区域的甲基化水平存在密切的关系。DNMT1与EZH2 的相互作用贡献于miR-200b/a/429 表达的下调，鉴于表观遗传学调控的复杂性，是否有其它蛋白或因子参与其中有待进一步研究探索。关键词：组蛋白修饰DNA甲基化miR-200 DNMT EZH2IAbstractOBJECTIVETomakeclearthemechanismthatDNMT1andEZH2inthe promoterregionofmiR-200b/a/429interactionsynergisticregulationofpromoter methylation.TostudythatregulationofmiR-200b/a/429expressionandtoexplore themechanismthatdown-regulationofmiR-200b/a/429andtheinfluencethat epigeneticsdrug5-azacytidine(5-Azacytidine)andDZNeponexpressionof miR-200b/a/429 and tumorgrowth.METHODSMGC-803,BGC-823(threegastriccancercells)andU87 (glioblastomacell)wereselectedfortheresearch.5-azacytidine(5-Azacytidine)or DZNepwasap