第五章_分子生物学研究法--DNA、RNA及蛋白质操作技术.pptVIP

第五章 分子生物学研究法(上) ——DNA、RNA及蛋白质操作技术 内容提要： 重组DNA技术回顾 DNA基本操作技术 RNA基本操作技术 SNP的理论与应用 基因克隆技术 蛋白质组与蛋白质组学技术 基因操作主要包括： DNA分子的切割与连接； 核酸分子杂交； 凝胶电泳； 细胞转化； 核酸序列分析以及基因人工合成； 定点突变和PCR扩增等。 基因工程： 指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 5. 1 重组DNA技术回顾 三大成就： 在20世纪40年代Avery确定了基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题； 50年代末至60年代，提出了“中心法则”和操纵子学说，阐明了遗传信息的流动与表达机制。 重组DNA技术史上的主要事件 （GMO转基因生物） 2003 美国科学家完成狗基因组全序列测定 中国科学家完成家蚕基因组全序列测定 2005 中、美、日科学家联合完成水稻基因组序列测定 美、德、日、意、以科学家完成黑猩猩基因组全序列测定 限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 双酶切 在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。如：病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。 获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种分子后，将其重新导入到寄主细胞中，通过细菌（如：大肠杆菌）转化，选择转化子，通过筛选，获得DNA重组表达。 并可在宿主细胞中保持下来，也可以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。 重组DNA操作过程： 重组DNA实验中常见的主要工具酶 5. 2 DNA操作技术 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及研究蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。 琼脂糖是从琼脂中提纯到的。它由β-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合形成的线性多聚糖。利用琼脂糖热溶液冷却时能凝胶化的特点，采用不同浓度的琼脂糖溶液，成球后可得到不同孔径的球状凝胶，用于分离核苷酸类化合物。 凝胶电泳的基本原理： 一种分子被放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。 电泳迁移率与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。 生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子，在电场中向正极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此都能以同样的速度向正电极方向迁移。 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量 ，也可以被清晰地检测出来。 EB（Ethidium bromide，溴化乙锭），分子式：C21H20BrN3，熔点：260 - 262°C ，是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。 溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用Polaroid 底片或带CCD成像头的凝胶成像处理系统拍摄。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。溴化乙锭是强诱变剂,具有高致癌性! EB可以被皮肤吸收。做实验时一定要带手套。 1 严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。2 废 EB溶液的处理方法(1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： a. 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/