ero1αdna甲基化在高同型半胱氨酸血症致肝脏脂代谢紊乱中作用的研究word格式论文.docx

宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日IIIERO1αDNA甲基化在高同型半胱氨酸血症致ApoE-/-鼠肝脏脂代谢紊乱中作用的研究摘要目的探讨HHcy与脂代谢相关基因ERO1αmRNA和蛋白表达的改变，以及ERO1α DNA甲基化在引起ApoE-/-鼠肝脏脂代谢紊乱形成过程中的作用，明确HHcy在ApoE-/-鼠脂代谢紊乱形成中对ERO1α表达及其DNA甲基化调控的影响。方法采用油红O染色法检测各组小鼠肝脏脂质沉积情况，酶标仪检测各组小鼠肝脏内TC和TG含量的变化，采用荧光定量PCR（RT-PCR）和Westernblot法检测ERO1α mRNA和蛋白的表达；采用巢式降落式PCR（ntMS-PCR）法检测ERO1α基因DNA甲基化改变，以ELISA法测各组小鼠肝脏内DNMT1 含量的变化。构建ERO1α和DNMT1 的重组表达质粒及siRNA并转染肝细胞，以RT-PCR法测ERO1α和DNMT1的mRNA 表达的变化，以Westernblot测ERO1α和DNMT1 蛋白表达的变化，以巢式降落式PCR 测ERO1α 基因甲基化修饰状态的改变。结果HHcy组小鼠肝脏脂质面积和血脂水平显著高于对照组与干预组（P0.01），与对照组比较，其肝脏脂质面积和血脂TC、TG分别升高约4.53、2.21、2.86倍，相关性分析结果显示，TC与其血清Hcy水平呈正相关（r2=0.1029，P0.01），TG与血清Hcy 水平呈正相关（r2=0.1216，P0.05）。荧光RT-PCR结果显示，与对照组相比，ApoE-/-对照组、HHcy组和干预组ERO1α 的表达分别下降至76.66％，20.43％和40.14％，差异有统计学意义（P0.01）。干预组与HHcy组相比，ERO1α表达升高1.96倍，差异有统计学意义(P0.01)。Westernblot 检测结果显示Hcy对ERO1α蛋白表达与对mRNA表达的影响是一致的。细胞水平上，与对照组比较，用50，100，200，500μmol/LHcy刺激细胞，ERO1α的mRNA表达分IV别下降至90.37％，55.44％，46.88％，36.93％，差异有统计学意义（P0.01），叶酸治疗组与100μmol/LHcy组比较，ERO1α的mRNA表达升高1.81 倍，差异有统计学意义（P0.05）。Westernblot检测结果显示Hcy对ERO1α蛋白表达与对mRNA表达的影响一致。构建ERO1α的重组质粒并转染肝细胞后检测ERO1α的mRNA和蛋白表达，结果显示，与对照组比较，EGFP-N1组ERO1α的mRNA水平无明显变化，而EGFP-N1- ERO1α组的mRNA水平增加至1.33倍，差异有统计学意义（P0.01），Westernblot 检测结果显示ERO1α蛋白表达与mRNA 表达一致。构建针对ERO1α的干扰片段（siRNA1，siRNA2，siRNA3）并分别转染肝细胞，检测ERO1α的mRNA和蛋白表达，结果显示，与对照组比较，各组ERO1α的mRNA水平分别降至61.06％，38.70％和69.41％，差异有统计学意义（P0.01），其中siRNA2 干扰效果最显著，Westernblot 检测结果显示ERO1α蛋白表达与mRNA表达一致。细胞内TC和TG检测结果显示，与对照组比较，Hcy+ EGFP-N1-ERO1α组分别下降至51.52％（P0.05）和60.89％（P0.01），而同时siRNA2组分别增加至1.39 倍（P0.05）和1.88 倍（P0.01）。启动子活性分析的结果显示，人类ERO1α的核心启动子存在活性，-1~-1100bp段的启动活性最强，与对照组比较差异有统计学意义(P0.01)，ntMS-PCR法检测ERO1α 基因启动子区DNA甲基化，结果表明，与对照组相比，HHcy组和治疗组的ERO1α