基于多重连接探针扩增技术mlpa高灵敏度检测多重microrna-mlpa high sensitivity detection of multiple microrna based on multiplex ligation probe amplification technology.docxVIP

保护知识产权声明本人为申请河北大学学位所提交的题目为(基辛急量li?钉，在针矿噜技示例伊)kY.艇在Lli2饨时crof.lVA，的学位论文，是我个人在导师(苍豆子〉指导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。，本人声明如下:本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。声明人:如3月t牵日期:血坐一年一月10日作者签名:怵峭博导师签名:在万象日期:卫生年6月10日日期:1-坐年6月l旦一日摘要MicroRNA（miRNA）是一类内源性的非编码小分子RNA，通过与目标信使RNA（mRNA）结合形成基因沉默复合物（RISC）调控基因的表达。MiRNA在细胞代谢、分化、免疫反应和肿瘤发生等生物过程中有重要的调控作用。许多研究表明，癌症组织中miRNA的表达异常通常与多种miRNA（一般是2-15个）有关。因此，建立一种灵敏度高、精密度好、可以同时检测多种miRNA的方法不仅在癌症的早期临床诊断和治疗方面有重要作用，对于深入了解肿瘤发生的机理也有重要的意义。本文建立了一种基于多重连接探针扩增技术（MLPA）高灵敏度检测多重miRNA的方法，使用RNA碱基修饰的DNA探针，以miRNA为模板，能够被T4RNAligase2高效连接。利用PCR对连接的探针扩增，毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可检测低至0.2fmol/L的let-7a，并且能区分miRNA序列中单个碱基的错配。我们随机选取了5种序列不相关的miRNA：mir-92a、mir-31、mir-143、mir-145和let-7a。该5种miRNA以不同长度的DNA探针进行编码，可在同一管PCR扩增反应中同时得到高灵敏度检测。将此方法进一步应用于A549细胞系（人类肺腺癌细胞株）中totalRNA的miRNA检测，可以同时检测出5种目标miRNA，表明此方法能用于实际样品分析。因此，基于MLPA多重检测miRNA技术提供了一种高灵敏度、高通量检测多种miRNA的方法。关键词microRNA多重探针连接聚合酶链式反应多重检测AbstractMicroRNAs(miRNAs)areaclassofendogenous,non-proteincodingandsmallRNAmoleculesthatplayimportantregulatoryrolesingeneexpressionbytheformationofanRNA-inducedsilencingcomplex(RISC)withtargetmRNA.Recently,miRNAshaveshowngreatimportanceinregulatingawidevarietyofbiologicalprocessesincludingcellproliferation,differentiation,immunologicalresponseandtumorigenesis.ManystudieshaveshownthatmiRNA-expressionalterationsinaspecificcancertissuegenerallyinvolvedseveralmiRNAspecies(typically2-15miRNAs).Therefore,sensitive,accurateandmultiplexedmiRNAdetectionhasgreatsignificanceforcancerdiagnosis,aswellasforbetterunderstandingofthemechanismoftumorigenesis.Inthispaper,wedemonstratedthattheDNAprobemodifiedwithtworibonucleotidescanbeefficientlyandspecificallyligatedwithT4RNAligase2templatedbymiRNAsbasedonmultiplexligation-dependentprobeamplification(MLPA).WithPCRamplificationfollowedbycapillaryelectrophoresis,aslowas0.2fmol/LtargetmiRNAcanbeaccuratelydeterminedandasingle-basedifferenceamongmiRNAsequenc